9個果蔗品種（系）遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜構建

賀爾奇 Pan Yong-Bao 付瑜華 雷石富 李向勇 盧加舉 張正學

摘要：【目的】對9個果蔗品種（系）進行遺傳多樣性分析并構建其DNA指紋圖譜，為果蔗品種鑒定和分子育種等提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷?1個SSR分子標記和毛細管電泳技術對來自4個省份的9個果蔗品種（系）進行遺傳多樣性分析，應用NTSYS-pc 2.11計算供試材料間遺傳相似系數(shù)，并運用UPGMA法進行聚類分析，同時構建其DNA指紋圖譜?！窘Y果】21對SSR引物共擴增出204條帶，多態(tài)性比例為75.99%，每對引物可擴增出4～31條帶，平均為9.71條。其中，17對引物含有9個果蔗品種（系）的44個特征位點，僅有5對引物鑒別能力最強，單個引物即可將其完全區(qū)分開。選擇多態(tài)性高、鑒別力強且含有品種（系）特征位點的3對引物（SMC36BUQ、SMC597CS和SMC851MS）構建了9份果蔗品種（系）基于44個位點的DNA指紋圖譜。9份果蔗材料的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.90，平均為0.77。UPGMA聚類結果顯示，9個果蔗材料可分為三大類群，且與材料來源地無直接關系?！窘Y論】9個果蔗品種（系）間的遺傳基礎差異較小，親緣關系較近，遺傳多樣性并不豐富，在育種中應加大果蔗親本遺傳背景的差異，提高其遺傳多樣性。

關鍵詞： 果蔗；SSR；遺傳多樣性；DNA指紋圖譜

中圖分類號： S566.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）11-1815-07

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for variety identification and parental selection during su-

garcane breeding process，the present study was conducted to analyze genetic diversity of nine chewing cane varieties（lines） and construct their DNA fingerprints. 【Method】Combining twenty-one SSR molecular markers with capillary electrophoresis technique，genetic diversities of nine chewing cane varieties（lines） from four provinces were analyzed，and genetic simi-

larity coefficient between tested materials was calculated using NTSYS-pc 2.11. Then nine chewing cane varieties（lines） were clustered for analysis using UPGMA，and their DNA fingerprints were constructed. 【Result】Results showed that，a total of 204 bands were amplified from nine chewing cane varieties（lines） using twenty-one pairs of SSR primers，with polymorphic rate of 75.99%. So every pair of SSR primers could amplify 4-31 bands，with an average of 9.71 bands. Seventeen pairs of primer contained 44 cultivar-specific loci of nine chewing cane varieties（lines）. Only five pairs of primers had the strongest ability to discriminate nine chewing cane varieties（lines），and each pair of primer was able to discriminate each chewing cane varieties（lines）. However，only three pairs of primers（SMC36BUQ，SMC597CS and SMC851MS），which were characterized by high polymorphism and discriminability and contained cultivar-specific loci，were chosen to construct DNA fingerprints of nine chewing cane varieties（lines）. Furethermore，genetic similarity coefficients among nine chewing cane varieties（lines） varied from 0.62 to 0.90，with an average of 0.77. UPGMA clustering result showed that，nine chewing cane materials were clustered into three groups，this result was not related to origins of materials. 【Conclusion】There are little differences in genetic basis，close genetic relationship and poor genetic diversity among nine chewing cane varieties（lines），so genetic background of parents should be increased in breeding process of new varieties.

Key words： chewing cane； SSR； genetic diversity； DNA fingerprint

0 引言

【研究意義】果蔗是一種可直接食用的水果甘蔗，具有皮薄質脆、汁多清甜、易咀嚼等特點，可用于解渴、解毒和保健，深受人們的喜愛（李瑞美等，2015）。近年來，隨著果蔗經(jīng)濟價值的提高，我國果蔗生產(chǎn)發(fā)展迅速，尤其在福建、廣東、廣西和貴州等地，其中以廣西推廣面積最大，僅百色隆林縣就超過100 ha，年收入超過2000萬元（馬世榮，2015），但仍無法滿足人們日益增長的需求（盧慶偉等，2015）。甘蔗常規(guī)育種工作量大、育種周期長、效率低，是當前甘蔗育種面臨的巨大挑戰(zhàn)。SSR（Simple sequence repeats）是基于PCR擴增的分子標記，具有數(shù)量多、多態(tài)性高、重復性好、不受環(huán)境因素和生育期的影響等優(yōu)點，已廣泛應用于物種遺傳多樣性分析、種質鑒定、基因定位及輔助育種等研究。因此，利用SSR分子標記分析現(xiàn)有果蔗品種的遺傳多樣性并構建其DNA指紋圖譜，對果蔗育種、品種鑒定及種質評價具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，已有大量利用SSR分子標記分析小麥（王立新等，2007）、大豆（趙波等，2008）、馬鈴薯（段艷鳳等，2009）、玉米（邵香蘭，2009）、棉花（尤春源等，2014；戴寶生等，2015）、水稻（蔡海亞等，2015）等作物的遺傳多樣性并構建其DNA指紋圖譜的研究報道。有關甘蔗遺傳多樣性分析研究報道較多，但有關其指紋圖譜構建的研究報道較少。Pan等（2003a，2003b）和Pan（2006）建立了基于毛細管電泳技術的甘蔗SSR分子標記檢測體系，利用該體系對甘蔗進行遺傳分析并構建育種常用親本基因型數(shù)據(jù)表，剔除錯標的無性系，大幅度提高了SSR分子標記在甘蔗育種效率。Chen等（2009）利用20個SSR分子標記對不同國家的35個甘蔗品種及5個近緣野生種進行遺傳親緣關系分析，研究發(fā)現(xiàn)40份材料的聚類結果與品種來源地和甘蔗演化進程中近緣野生種的利用率順序基本一致。梁俊等（2010a，2010b）將SSR分子標記與毛細管電泳技術相結合對甘蔗屬3個不同種的12個材料進行遺傳多樣性及遺傳關系分析，并對52個甘蔗品種進行同源性分析，結果表明參試品種間同源性為55%～87%，彼此間遺傳基礎相近，且構建了基于141個SSR分子標記的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。劉新龍等（2010a，2010b）利用SSR分子標記對云南甘蔗品種進行遺傳關系及遺傳多樣性分析，為當?shù)馗收嵊N親本選擇和雜交組合配制提供理論指導，并從18個質量性狀和5個數(shù)量性狀對73個云南甘蔗品種和27個其他省份主栽甘蔗品種進行遺傳變異和遺傳多樣性分析，結果表明品種的遺傳相似性處于中等水平。姚春雪等（2011）對67份崖城89/9×昆明蔗茅雜種不同世代及其親本材料進行SSR多態(tài)性分析，并利用234個SSR分子標記組合構建供試材料的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，結果表明雜交后代材料間存在明顯的遺傳差異?！颈狙芯壳腥朦c】雖然果蔗具有較高的經(jīng)濟價值，但基于分子標記的遺傳多樣性分析、種質鑒定、基因定位及輔助育種等研究遠落后于糖蔗，鮮見果蔗遺傳多樣性分析并構建其DNA指紋圖譜的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】將SSR分子標記和毛細管電泳技術相結合，以來自4個省份的9個果蔗品種（系）為試驗材料，利用21對SSR引物對其進行遺傳多樣性分析并構建DNA指紋圖譜，為果蔗的生產(chǎn)應用及種質創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試果蔗材料（表1）由貴州省亞熱帶作物研究所望謨甘蔗育種場提供。在甘蔗生長期，剪取各果蔗品種（系）植株頂部新鮮葉片，裝入15 mL離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。選用21對多態(tài)性較高的引物（表2）（Pan，2006；Chandra et al.，2014），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，且上游引物5'端標記FAM。主要儀器設備：SANYO SIM-F14全自動制冰機、LDZX- 40B立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋、TGL-16G高速臺式冷凍離心機、DYY-6B電泳儀、GELl-DOC2000凝膠成像分析儀、Bio-Rad PCR擴增儀、ABI 3730XL電泳儀等。CTAB提取液：100.00 mmol NaCl，20.00 mmol EDTA（pH 8.0），2% CTAB（w/v），100.00 mmol Tris- HCl；苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），氯仿/異戊醇（24∶1）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 果蔗DNA提取參照Pan等（2000）的方法，用分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 PCR擴增與毛細管電泳 PCR反應體系10.00 μL：dNTP 80.00 mmol/L，上、下游引物各0.20 mmol/L，DNA模板10.0 ng，MgCl2 2.50 mmol/L，KCl 50.00 mmol/L，Tris-HCl 10.00 mmol/L和1.0 U Taq DNA聚合酶。擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s（退火溫度見表2），72 ℃ 30 s，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。對PCR產(chǎn)物進行毛細管電泳分離，GS500為分子量內標，估算擴增片段大小。

1. 2. 3 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)9個果蔗材料的毛細管電泳圖譜，計算條帶數(shù)目、大小和多態(tài)性比例，應用NTSYS-pc 2.11計算各材料間遺傳相似系數(shù)；運用UPGMA法進行聚類分析；利用GeneMapper v3.0和Powerpoint制作毛細管電泳分離圖譜，再根據(jù)無帶和有帶情況轉化為0、1數(shù)據(jù)矩陣。

2 結果與分析

2. 1 SSR多態(tài)性分析結果

對9個果蔗材料的PCR產(chǎn)物進行毛細管電泳分離，并通過GeneMapper v3.0和Powerpoint制作其毛細管電泳分離圖譜（圖1）。以SMC336BS為引物的擴增條帶大小在141～183 bp，條帶數(shù)在不同供試果蔗品種（系）間不同，其中以黔糖3號、黔蔗06/126和黔糖08/688的最多，達5條。此外，根據(jù)21對SSR引物擴增產(chǎn)物的毛細管電泳分離圖譜，對9個果蔗材料進行SSR多態(tài)性分析，結果如表3所示，21對SSR引物共擴增出204條帶，條帶大小為38～258 bp，多態(tài)性條帶145條，多態(tài)性條帶比例為35.48%～100.00%，平均為75.99%。每對引物可擴增出4～31條帶，平均為9.71條。此外，21對SSR引物中有17對含9個果蔗品種（系）的44個特征位點，可作為品種（系）的特異引物，利用特異引物可快速與其他8個材料區(qū)分開。其中，有5對SSR引物（SMC31CUQ、SMC36BUQ、SMC597CS、SMC851MS和mSSCIR43）鑒別能力最強，僅用單對引物即可將9份果蔗品種（系）區(qū)分開。

2. 2 遺傳相似性分析結果

利用NTSYS-pc 2.11對9個果蔗材料進行遺傳相似性分析，結果如表4所示，9個果蔗品種（系）的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.90，平均為0.77，表明其遺傳多樣性并不豐富。其中，黔糖3號和黔糖08/688間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.90，表明兩者的遺傳基礎一致性較高，親緣關系較近；沱江紅和安徽白皮間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.62，表明兩者的遺傳基礎差異較大，親緣關系較遠。貴州選育的黔糖系列（黔糖06/222、黔糖5號、黔糖3號和黔糖08/688）果蔗無性系間的相似系數(shù)為0.68～0.90，親緣關系較近。

2. 3 聚類分析結果

基于SSR分子標記對9個果蔗品種（系）進行聚類分析，結果如圖2所示，在遺傳相似系數(shù)為0.684處，可將9個果蔗品種（系）分為三大類群：類群I包括2個果蔗品種和1個品系，分別為安徽白皮、廣東黃皮和黔糖06/222；類群II為最大類群，包括2個果蔗品種和3個品系，又可進一步分為兩個亞類群（A和B），A類群包括黔蔗06/126、黔糖3號、黔糖08/688和四川白善蔗；B類群僅包括黔糖5號；類群III僅包括沱江紅。上述結果表明，9個果蔗品種（系）的遺傳基礎差異較小，親緣關系較近，聚類結果和材料的地理來源無直接關系。

2. 4 指紋圖譜構建

根據(jù)用最少的引物構建供試材料DNA指紋圖譜的原則，并綜合考慮該指紋圖譜的廣泛適用性，即在擴充供試果蔗材料的情況仍具有種質鑒別能力。本研究根據(jù)各供試品種（系）特征位點選用多態(tài)性高、鑒別能力強的3對SSR引物（SMC36BUQ、SMC597CS和SMC851MS）構建了其DNA指紋圖譜。由表5可知，從9個果蔗材料共擴增出44個特征位點，且品種（系）間DNA指紋圖譜存在明顯差異，表明利用該指紋圖譜可將9個供試品種（系）進行區(qū)分。因此，所建立的指紋圖譜可用于果蔗品種（系）的親緣關系和品種鑒定。

3 討論

本研究選用的21對SSR引物在甘蔗屬不同栽培種和野生近緣種的遺傳基礎評價中均表現(xiàn)出高多態(tài)性（梁俊等，2010b；劉新龍等，2010b；姚春雪等，2011），已被廣泛應用于甘蔗品種選育和種質鑒定（Pan et al.，2003a，2003b；Pan，2006；Chen et al.，2009）。雖然我國目前尚無統(tǒng)一的甘蔗分子身份數(shù)據(jù)庫，但作為被世界甘蔗育種家廣泛采用的SSR引物，這21對SSR引物可視為甘蔗遺傳基礎評價的核心SSR引物。因此，本研究獲得的9個果蔗品種（系）的SSR多樣性分析結果，具有廣泛適用性，可為不同蔗區(qū)果蔗品種（系）的真實性檢測提供依據(jù)。另外，17個SSR引物含有9個果蔗品種（系）的44個特征位點，因此，在甘蔗種質區(qū)分或品種鑒定研究中，若供試材料包含9個果蔗品種（系）中的其中之一時，可選用該果蔗品種（系）的特異引物快速準確將其與其他材料區(qū)分開。本研究根據(jù)用最少的引物組合鑒別盡可能多的供試材料原則，并綜合考慮指紋圖譜廣泛適用性，選用多態(tài)性高、鑒別能力強并含有特征位點的3對SSR引物構建了基于44個特征位點的9個果蔗品種（系）的DNA指紋圖譜，可為保護育種機構的知識產(chǎn)權提供科學依據(jù)。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)9個果蔗品種（系）的遺傳基礎一致性較高，遺傳多樣性并不豐富，且聚類分析結果和材料的地理來源無直接關系。該結論與梁俊等（2010b）的研究結果一致，其原因主要為包括果蔗在內的甘蔗育種均為高貴化育種，現(xiàn)代甘蔗栽培品種的血緣主要來自于熱帶種和割手密。雖然供試果蔗品種（系）來自不同省份，但由于選用的親本遺傳基礎相近，導致育出的果蔗品種（系）間遺傳基礎差異較小。因此，果蔗新品種的選育應像糖蔗一樣，在保證適口性和商品性的同時，適當引入斑茅、蔗茅等野生近緣種的遺傳資源，擴大果蔗品種（系）的遺傳多樣性。

4 結論

9個果蔗品種（系）間的遺傳基礎差異較小，親緣關系較近，遺傳多樣性并不豐富，在育種中應加大果蔗親本的遺傳背景差異，提高果蔗品種（系）的遺傳多樣性。

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（責任編輯 陳 燕）