乙醇回流法提取葛根黃酮的工藝優(yōu)化研究

朱德艷（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門(mén)448000）

乙醇回流法提取葛根黃酮的工藝優(yōu)化研究

朱德艷
（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門(mén)448000）

采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化乙醇回流法提取葛根黃酮的工藝研究。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇回流溫度、回流時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)四個(gè)因素，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，評(píng)估了這些因素對(duì)葛根黃酮提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明最佳工藝參數(shù)為回流溫度90℃，提取時(shí)間120 min，料液比1∶40（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。在此條件下，葛根黃酮的提取率為1.62%。

葛根；總黃酮；提??；正交設(shè)計(jì)

葛根為豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，具有解肌、退熱、生津、透疹、升陽(yáng)、止瀉之功效，主要治療外感發(fā)熱、頭痛、高血壓等疾病［1］。隨著現(xiàn)代醫(yī)藥、食品科技的發(fā)展，葛根的使用價(jià)值越來(lái)越引起人們的關(guān)注［2］。我國(guó)葛根資源相當(dāng)豐富，除

青海、西藏、新疆外，各省都有分布［3］。葛根的主要成分是黃酮類、異黃酮類、葛根淀粉等。

葛根黃酮主要成分包括葛根素、羥基葛根素、甲氧基葛根素、大豆甙等黃酮類化合物，還有三萜類、香豆素類等［4］。葛根黃酮含量大約占葛根總量的12%。葛根黃酮目前主要用于治療心腦血管疾病，如高血壓、高血脂、偏頭痛、冠心病、心肌梗塞、心絞痛等癥狀。還可代替中成藥中的中藥葛根，同時(shí)葛根黃酮還可運(yùn)用于保健食品，用于解酒、延緩更年期、糖尿病引起的并發(fā)癥等領(lǐng)域［5］。

已報(bào)道的葛根黃酮提取方法有很多，如水提取法、有機(jī)溶劑提取法、堿液法、超聲波法、微波萃取法、超臨界萃取等［6-11］。葛根黃酮作為許多藥物與保健品的主要功能成分具有重要價(jià)值，其提取與功能應(yīng)用的研究是目前熱點(diǎn)之一。韓劍等［12］采用正交試驗(yàn)對(duì)葛根藥材的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化；趙浩如等［13］綜合分析幾種方法后認(rèn)為滲濾法是較為適宜的提取方法；彭游等［14］利用微波輔助萃取法提取葛根黃酮，效果良好；張喜梅等［15］采用超聲波法從葛根中提取總黃酮；邢秀芳等［16］將葛根用纖維素酶加以分解，后用乙醇與正丁醇萃取得總黃酮；王星敏等［17］采用生物酶促發(fā)酵降解葛根廢渣的植物組織，有效地提取葛根黃酮。本試驗(yàn)主要對(duì)乙醇回流法從葛根中提取葛根黃酮的相關(guān)工藝進(jìn)行了研究，以期使湖北荊門(mén)地區(qū)的葛根資源得到更充分利用，為葛根深加工和綜合利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葛根：湖北省仙之靈食品有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品鑒定所；體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇：武漢市洪山中南化工試劑有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純）：天津福晨化學(xué)試劑廠。

1.2儀器與設(shè)備

F120型粉碎機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；SHZ-3循環(huán)水多用真空泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DK-98-ⅡA恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；AB104-N電子分析天平：上海梅特勒—托利多儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線［11］

稱取蘆丁0.1 g，加入體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶解定容至100 mL，再轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶用水定容，分別吸取0、1 mL、2 mL、3 mL、4mL、5mL于6個(gè)10mL試管中，分別標(biāo)號(hào)0、1、2、3、4、5、6。加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min，加入0.3 mL10%硝酸鋁溶液，靜置6 min，再加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，靜置15 min。最后分別加入蒸餾水將6個(gè)試管補(bǔ)足至10 mL。在波長(zhǎng)510 nm處，以0號(hào)試管中溶液作為空白液測(cè)定吸光度值，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪圖。

1.3.2樣品中葛根黃酮的測(cè)定

根據(jù)1.3.1中相關(guān)結(jié)果繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定樣品中葛根黃酮的吸光度值，利用線性回歸方程得到葛根黃酮的質(zhì)量濃度［4］，黃酮提取率計(jì)算公式如下：

式中：V為葛根黃酮提取液的體積，mL；M為葛根樣品質(zhì)量，g；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到的葛根黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.3葛根黃酮的提取工藝流程及操作要點(diǎn)

葛根→預(yù)處理→粉碎→乙醇回流浸提→離心→上清液→定容→紫外分光光度計(jì)測(cè)定葛根黃酮含量

操作要點(diǎn)：取葛根適量，用清水清洗表面，除去相關(guān)泥土及表面污漬。將葛根放入干燥器60 min。用菜刀將葛根切成長(zhǎng)寬高各1 cm小方塊方便粉碎。粉碎葛根，稱取5 g葛根樣品若干份，備用。在不同溫度、不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、不同回流時(shí)間、不同料液比等條件下回流?；亓魍瓿珊蠓謩e用真空泵抽濾至固液完全分離，將抽濾的溶液放入燒杯中。用移液槍從5個(gè)燒杯中各取1 mL溶液置于5支不同試管中。另取一支空白試管，加入1 mL蒸餾水。在6支試管中各加入0.3 mL5%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min，再各加0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min，最后各加4 mL 4%氫氧化鈉溶液，靜置10 min，最后用蒸餾水將6支試管補(bǔ)足至10 mL。在波長(zhǎng)為510 nm下測(cè)定吸光度值，并根據(jù)1.3.2計(jì)算樣品中葛根黃酮的提取率。

1.3.4單因素試驗(yàn)

乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定：選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%，在料液比為1∶40（g∶mL），回流溫度70℃的條件下回流120 min，計(jì)算葛根黃酮的提取率。

回流溫度的確定：選擇回流溫度為60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶40（g∶mL）條件下回流120 min，計(jì)算葛根黃酮的提取率。

料液比的確定：選擇料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL），在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，回流溫度為80℃的條件下回流120 min，計(jì)算葛根黃酮的提取率。

回流時(shí)間的確定：選擇回流時(shí)間為60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，回流溫度為80℃，料液比為1∶40（g∶mL）的條件下回流，計(jì)算葛根黃酮的提取率。

1.3.5正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了找尋最佳的提取葛根黃酮的最佳條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、回流溫度、料液比、回流時(shí)間4個(gè)因素為考察因素，以葛根黃酮的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化乙醇回流的條件，因素與水平見(jiàn)表1。

表1　葛根黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for flavonoids extraction condition optimization from radixPueraria

2　結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X）、吸光度值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=9.894 3X+0.002 1，R2=0.994 5，結(jié)果表明蘆丁質(zhì)量濃度和吸光度值線性關(guān)系良好。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根黃酮提取的影響

圖2　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根黃酮提取影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on flavonoids extraction from radixPueraria

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，回流溫度70℃，回流時(shí)間120 min，考察不同的料液比對(duì)葛根黃酮提取率的影響。

由圖2可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，葛根黃酮提取率增大；乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%～90%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，葛根黃酮提取率減小。分析其原因?yàn)楫?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加時(shí)，溶液中葛根黃酮溶解增多，提取率增大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞70%時(shí)，葛根中多糖等其他物質(zhì)開(kāi)始溶解，從而影響黃酮的溶解，因此提取率減小。故提取葛根黃酮的最適宜乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2.2回流溫度對(duì)葛根黃酮提取的影響

選取料液比為1∶40（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，回流時(shí)間120 min，考察不同的溫度對(duì)葛根黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　回流溫度對(duì)葛根黃酮提取的影響Fig.3 Effects of refluxing temperature on flavonoids extraction from radixPueraria

由圖3可知，提取溫度在60～80℃，隨著溫度的升高，提取液中有效成分浸出增加，葛根黃酮提取率增大；當(dāng)溫度＞80℃后，隨著溫度的升高，可能引起黃酮結(jié)構(gòu)破壞，黃酮被氧化，從而黃酮提取率減小。故提取葛根黃酮的最適宜溫度為80℃。

2.2.3料液比對(duì)葛根黃酮提取的影響

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，回流溫度80℃，回流時(shí)間120 min，考察不同的料液比對(duì)葛根黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　料液比對(duì)葛根黃酮提取影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on flavonoids extraction from radixPueraria

由圖4可知，在料液比1∶20～1∶40（g∶mL），隨著溶劑量的增加，葛根黃酮由內(nèi)向外擴(kuò)散速度加快，提取率就逐漸增大；當(dāng)料液比＞1∶40（g∶mL）后，葛根黃酮的溶解基本達(dá)到飽和，黃酮擴(kuò)散速度減慢，黃酮提取率不再增加。提取葛根黃酮的最適宜料液比為1∶40（g∶mL）。

2.2.4回流時(shí)間對(duì)葛根黃酮提取的影響

選取料液比為1∶40（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，回流溫度80℃，考察不同的回流時(shí)間對(duì)葛根黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5　回流時(shí)間對(duì)葛根黃酮的影響Fig.5 Effects of refluxing time on flavonoids extraction from radixPueraria

由圖5可知，在回流時(shí)間60～120min，隨著時(shí)間的推移，黃酮提取率增大；在回流時(shí)間為120min時(shí)提取率最高；在回流時(shí)間＞120min后，由于加熱回流的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，黃酮類物質(zhì)容易被氧化而破壞，這樣會(huì)造成部分總黃酮的降解而導(dǎo)致提取率降低，提取葛根黃酮的最適宜回流時(shí)間為120 min。

2.3正交試驗(yàn)

表2　葛根黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for optimization of flavonoids extraction condition from radixPueraria

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、回流溫度、料液比、回流時(shí)間4個(gè)因素為考察因素，以葛根黃酮的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化乙醇回流的條件，結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

根據(jù)表2正交試驗(yàn)結(jié)果得出，乙醇回流法提取葛根黃酮最佳組合為A2B3C2D2，即最適宜工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取溫度為90℃，提取時(shí)間為120 min，最適宜料液比為1∶40（g∶mL）。對(duì)結(jié)果影響因素大小B＞A＞C＞D，即影響葛根黃酮提取的因素大小為回流溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞回流時(shí)間。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，葛根黃酮的提取率為1.62%。

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表3方差分析結(jié)果可知，結(jié)果顯示因素A、B、C和D都對(duì)葛根黃酮提取率有極顯著的影響（P＜0.01），4個(gè)因素對(duì)葛根黃酮提取的影響主次順序?yàn)锽＞A＞C＞D。

3　結(jié)論

乙醇回流法提取葛根黃酮工藝最佳參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取溫度為90℃，提取時(shí)間為120 min，最適宜料液比為1∶40（g∶mL），在此最佳條件下其總黃酮提取率可達(dá)1.62%。影響葛根黃酮提取效果各因素的主次順序?yàn)榛亓鳒囟龋疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞料液比＞回流時(shí)間，方差分析表明，提取葛根黃酮工藝中應(yīng)關(guān)鍵控制回流溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)。乙醇回流法相對(duì)其他提取方法，操作步驟簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低，生產(chǎn)周期短，可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)葛根黃酮提供理論基礎(chǔ)。

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Optimization of flavonoids extraction technology from radixPueraria

ZHU Deyan
（College of Bioengineering，Jingchu University of Technology，Jingmen 448000，China）

The flavoniods extraction form radixPuerariawas studied by ethanol-reflux method.Based on single experiments，temperature，time，material to liquid ratio，and ethanol concentration were selected as evaluation factors for orthogonal test.The effect of the factors on flavonoids extraction rate was investigated.The results indicated that the optimal extraction conditions were temperature 90℃，time 120 min，material to liquid ratio 1∶40（g∶ml）and ethanol concentration 70%.Under the optimized conditions，the extraction yield of flavonoids from radixPuerariawas up to 1.62%.

radixPueraria；flavonoids；extraction；orthogonal test

TS201.1

A

0254-5071（2015）11-0145-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.033

2015-09-19

湖北省荊門(mén)市科技局項(xiàng)目（2012YD05）

朱德艷（1977-），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)樯镏扑幖夹g(shù)。