視交叉上核損毀對(duì)小鼠疼痛日節(jié)律行為的影響

張 靖，陰 彬，孫中生，彭小忠*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.神經(jīng)科學(xué)中心, 北京 100005； 3.中國科學(xué)院 北京生命科學(xué)研究院, 北京 100101)

研究論文

視交叉上核損毀對(duì)小鼠疼痛日節(jié)律行為的影響

張 靖1,2，陰 彬1,2，孫中生3，彭小忠1,2*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.神經(jīng)科學(xué)中心, 北京 100005； 3.中國科學(xué)院 北京生命科學(xué)研究院, 北京 100101)

目的通過建立視交叉上核(SCN)損毀實(shí)驗(yàn)建立小鼠節(jié)律調(diào)控中樞失能模型，觀察中樞節(jié)律控制中心SCN對(duì)疼痛節(jié)律行為的影響。方法1)12 h 光照/12 h黑暗條件下觀察小鼠甲醛誘導(dǎo)的炎性痛反應(yīng)的節(jié)律波動(dòng)； 2)SCN損毀建立小鼠節(jié)律中樞失能模型，觀察小鼠轉(zhuǎn)輪節(jié)律行為紊亂； 3)觀察SCN損毀后小鼠甲醛誘導(dǎo)的炎性痛日節(jié)律波動(dòng)特征的改變。結(jié)果1)12 h光照/12 h黑暗條件下小鼠的甲醛誘導(dǎo)炎性痛存在日節(jié)律波動(dòng)； 2)SCN損毀后小鼠正常的炎性痛日節(jié)律波動(dòng)特點(diǎn)明顯改變，出現(xiàn)活動(dòng)期與靜息期波動(dòng)峰值的反轉(zhuǎn)。結(jié)論腦內(nèi)的節(jié)律調(diào)控中樞SCN對(duì)小鼠炎性痛的節(jié)律波動(dòng)具有中樞調(diào)控作用。

疼痛; 甲醛; 炎性痛; 視交叉上核; 日節(jié)律

疼痛是一種機(jī)制非常復(fù)雜的神經(jīng)活動(dòng)，也是一組復(fù)雜的生理、病理和心理改變的臨床表現(xiàn)[1]。研究疼痛感覺隨時(shí)間變化的規(guī)律和影響因素對(duì)提出救治臨床“痛癥”的科學(xué)用藥具有重要意義。

視交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)是哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律系統(tǒng)調(diào)節(jié)的中樞結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生對(duì)睡眠-覺醒、激素、代謝和生殖等一系列生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)，多種生理、行為活動(dòng)的紊亂均與SCN功能異常有關(guān)[2- 3]。SCN一般會(huì)利用光照進(jìn)行生物鐘校準(zhǔn)，但是即便在全黑環(huán)境，其內(nèi)神經(jīng)元也能讓動(dòng)物保持晝夜節(jié)律。 環(huán)境因子被稱為同步器，建立在同步器上的節(jié)律時(shí)間被稱為給時(shí)時(shí)間(zeitgeber time，ZT)，而持續(xù)黑暗環(huán)境則稱為持續(xù)黑暗時(shí)間(consistent dark time,CT)[4- 6]。

以往研究證實(shí)，小鼠的多種疼痛行為呈現(xiàn)晝夜節(jié)律變化的特性，如甲醛誘導(dǎo)的炎性痛，以及熱刺激和機(jī)械刺激的疼痛反應(yīng)等[7- 8]。甲醛誘導(dǎo)的疼痛節(jié)律與脊髓背根結(jié)內(nèi)表達(dá)的P物質(zhì)的功能密切相關(guān)[7]，但是，甲醛誘導(dǎo)炎性痛的晝夜節(jié)律是否與SCN功能有關(guān)至今尚無證據(jù)。本研究即針對(duì)SCN對(duì)炎性痛晝夜節(jié)律的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察和分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及節(jié)律行為數(shù)據(jù)采集及分析

12周齡SPF級(jí)C57品系雄性小鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；合格證號(hào):SCXK(京)2006-0009]，按照12 h光照/12 h黑暗，自由取食、飲水飼養(yǎng)條件喂養(yǎng)。光照條件馴化方案參見文獻(xiàn)[5- 7]。動(dòng)物節(jié)律行為監(jiān)測：小鼠作息規(guī)律監(jiān)測采用轉(zhuǎn)輪自動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)記錄。

1.2 SCN損毀手術(shù)

采用電損毀法破壞小鼠雙側(cè)SCN。SCN的腦立體定位參考已發(fā)表文獻(xiàn)[6- 7]及小鼠腦圖譜(George P，2001)，并根據(jù)采集動(dòng)物樣本的實(shí)測數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。SCN坐標(biāo)為：前囟(bregma)后0.4 mm，中線(midline)側(cè)0.3 mm，硬腦膜(dura)下5.1 mm。損毀電極尖端直徑0.1 mm，尖端裸露0.5 mm。SCN施雙側(cè)損毀，電流1.0 mA，15 s。對(duì)照組為未實(shí)施手術(shù)組小鼠，假手術(shù)組為手術(shù)方法與損毀組相同，但損毀電極僅插入SCN上方不做電流擊損。術(shù)后5～7 d，待小鼠機(jī)能狀態(tài)恢復(fù)正常后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察。

1.3 疼痛行為學(xué)觀察

經(jīng)30 min測試實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)后，實(shí)驗(yàn)組小鼠接受足底皮下甲醛(5%, 10 μL)注射，注射后立即進(jìn)行疼痛行為學(xué)觀察，觀察方法參見文獻(xiàn)[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同光照周期條件下小鼠的節(jié)律行為

小鼠活動(dòng)期為ZT12(18∶00pm)至ZT24(6∶00am)，靜息期為ZT0(6∶00am)至ZT12(18∶00pm)。經(jīng)全黑暗環(huán)境馴化9 d后，小鼠每日活動(dòng)期起始時(shí)間點(diǎn)(CT12)如箭頭示。全黑環(huán)境對(duì)小鼠節(jié)律的影響：其每日活動(dòng)期起始時(shí)間出現(xiàn)了穩(wěn)定漂移，小鼠內(nèi)源性節(jié)律為23 h 40 min左右(圖1)。

The black and white bar is shown the condition with the 12 h light-12 h dark cycle (zeitgeber time, ZT), and CT were the constant darkness condition with 9 days;CT12.the start time point of CT time for active phase in each day of mice圖1 12 h/12 h明-暗同步馴化及全黑暗環(huán)境馴化9 d小鼠運(yùn)動(dòng)-睡眠節(jié)律Fig 1 The histograms are displayed circadian rhythm of the wheel running behavior of mice in the different light conditions

2.2 SCN損毀后小鼠轉(zhuǎn)輪晝夜節(jié)律行為改變

小鼠經(jīng)SCN損毀手術(shù)后，首先進(jìn)行了損毀部位的形態(tài)學(xué)檢測(Nissl-staining)，檢測結(jié)果如圖2所示。從結(jié)果中可以觀察到，假手術(shù)組(sham)小鼠下丘腦部位SCN形態(tài)完整未受損傷，而手術(shù)組(surgery)小鼠的SCN已消失(圖2)。

損毀SCN后，小鼠放置于轉(zhuǎn)錄節(jié)律檢測系統(tǒng)進(jìn)行觀察記錄。結(jié)果發(fā)現(xiàn),術(shù)后正常光照條件下手術(shù)組小鼠依然可以保持穩(wěn)定的晝夜節(jié)律行為，但是在短期(18 d)的全黑環(huán)境中手術(shù)組小鼠即表現(xiàn)出晝夜節(jié)律的紊亂(圖3)。在CT環(huán)境中長期(112 d)觀察，SCN損毀后對(duì)小鼠節(jié)律行為的影響則更為顯著，且再次恢復(fù)至明暗交替給時(shí)環(huán)境，已經(jīng)消失的晝夜節(jié)律仍可恢復(fù)(圖4)。

2.3SCN損毀后小鼠轉(zhuǎn)輪炎性痛晝夜節(jié)律產(chǎn)生翻轉(zhuǎn)

對(duì)照組小鼠的急性傷害性行為反應(yīng)在靜息期(ZT4)和活動(dòng)期(ZT20)之間沒有顯著性差異(圖5A)；在手術(shù)組中，小鼠急性傷害性行為反應(yīng)在靜息期(ZT4)和活動(dòng)期(ZT20)之間也沒有顯著性差異(圖5B)。

但是，對(duì)照組中甲醛誘導(dǎo)的炎性痛具有節(jié)律波動(dòng)的特點(diǎn)，且靜息期(ZT4)比活動(dòng)期(ZT20)反應(yīng)強(qiáng)烈(圖5C，Plt;0.001；F=16.1)， 這與過去的觀察一致[8]。然而，手術(shù)組則呈現(xiàn)出了不同的特點(diǎn)，產(chǎn)生了晝夜之間疼痛反應(yīng)強(qiáng)度的翻轉(zhuǎn)：活動(dòng)期(ZT20)比靜息期(ZT4)反應(yīng)強(qiáng)烈(圖5D，Plt;0.01；F=5.75)。

A.morphology of SCN in three groups of naive, sham and surgery(×4); B.morphology of SCN in three groups (×10)圖2 SCN損毀后小鼠下丘腦部位的形態(tài)學(xué)檢測Fig 2 A complete SCN lesion result was confirmed by Nissl-staining

The bars at top or bottom represent light (gray) / dark (black) cycles or constant darkness, respectively圖3 SCN損毀后小鼠置于明暗交替條件和全黑環(huán)境中轉(zhuǎn)輪行為Fig 3 Wheel running activity after SCN lesion surgery

It was shown an entire disruption of the circadian rhythm of running wheel behavior in the long-term constant darkness; the red bars are shown the short outage of electric power in the monitor system

圖4SCN損毀小鼠在長期全黑環(huán)境(112d)中晝夜節(jié)律喪失
Fig4WheelrunningactivityafterSCNlesionsurgeryinthelong-term(112days)constantdarkness

The histograms are displayed an overturned pattern of nociceptive responses between ZT4 and ZT20； *Plt;0.05， **Plt;0.001 compared with ZT4

3 討論

生物鐘研究領(lǐng)域最早認(rèn)識(shí)的節(jié)律振蕩器是位于腦內(nèi)下丘腦部的SCN。直到今天仍習(xí)慣稱之為生物鐘系統(tǒng)的“主鐘”(master clock)[2- 6]。SCN損毀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一旦SCN的功能喪失，大鼠各種內(nèi)源性行為的晝夜節(jié)律以及激素分泌的晝夜節(jié)律隨即消失，甚至連大鼠夜行性的行為規(guī)律也將遭到破壞[2- 3]。本研究也證明了SCN對(duì)于小鼠自主運(yùn)動(dòng)行為晝夜節(jié)律的重要調(diào)節(jié)作用，該調(diào)節(jié)作用一旦消失，小鼠則無法維持正常的晝夜節(jié)律，這一點(diǎn)與以往的研究結(jié)果吻合[5]。

現(xiàn)有的研究證據(jù)已經(jīng)表明，體內(nèi)生物鐘系統(tǒng)除了下丘腦SCN起著重要的調(diào)節(jié)功能之外，其他外周器官和組織也還廣泛地分布著許多局部的生物鐘環(huán)路，并且也調(diào)節(jié)著重要的具體節(jié)律生理活動(dòng)[4]。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常生理?xiàng)l件下小鼠的甲醛誘導(dǎo)炎性痛存在晝夜節(jié)律，且受到背根神經(jīng)結(jié)內(nèi)表達(dá)的P物質(zhì)的調(diào)節(jié)，這表明P物質(zhì)在脊髓背根節(jié)內(nèi)的節(jié)律性生成，并向突觸終末的節(jié)律性運(yùn)輸是產(chǎn)生炎性痛反應(yīng)晝夜節(jié)律的關(guān)鍵因素[7]。本研究結(jié)果表明，中樞重要的節(jié)律振蕩器SCN對(duì)于維持正常的疼痛晝夜節(jié)律特征具有重要的意義，一旦功能喪失則出現(xiàn)晝夜顛倒的情況。

SCN影響一些外周器官的節(jié)律性功能可以依賴自主神經(jīng)系統(tǒng)或激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而這些系統(tǒng)和感覺系統(tǒng)的初級(jí)中樞也存在廣泛的聯(lián)系，甚至也影響著傷害性信息上行通路的工作[9]，因此，也可以認(rèn)為這些系統(tǒng)可能對(duì)炎性痛反應(yīng)存在復(fù)雜的影響。不過，本研究雖然從SCN損毀手術(shù)模型上觀察到了小鼠炎性痛晝夜節(jié)律異常的證據(jù)，但是其背后深層次的分子生物學(xué)機(jī)制值得在未來的工作中進(jìn)一步探討。

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Suprachiasmatic nucleus lesioninduced abnormal rhythm of circadian inflammatory pain

ZHANG Jing1,2, YIN Bin1,2, SUN Zhong-sheng3, PENG Xiao-zhong1,2*

(1.State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Dept. of Molecular Biology and Biochemistry，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS，Beijing 100005; 2.Neuroscience Center，CAMS，Beijing 100005;3.Beijing Institutes of Life Science, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

ObjectiveTo investigate the regulation of suprachiasmatic nucleus (SCN) on the inflammatory pain in mice at behavioral level.MethodsWheel running of circadian behavioral monitor system, the surgery of SCN lesion and the formalin induced nociceptive responses test were employed to analyze the synchronize and/or maintain circadian function of SCN in modulating the rhythm of inflammatory pain induced by formalin in mice.ResultsOur results showed that the formalin induced inflammatory nociceptive responses were shown a circadian oscillation pattern in resting phase (ZT4) and active phase (ZT20), and after SCN lesion, the mice were shown an overturned pattern of nociceptive responses between ZT4 and ZT20 compared with normal control.ConclusionsThe circadian synchronized function is an important regulator for maintaining normal daily fluctuation patterns of inflammatory pain induced by formalin.

pain; formalin; inflammatory pain; suprachiasmatic nucleus (SCN); circadian rhythm

2014- 03- 17

2014- 04- 15

國家自然科學(xué)基金(31370789)

*通信作者(correspondingauthor)：peng_xiaozhong@163.com

1001-6325(2014)06-0787-05

Q 522

A