AZD8055抑制肝癌huh7細(xì)胞增殖和促細(xì)胞凋亡

李 鵬，王亞紅，楊拉維，楊 騰，何香紅，黃海麗

(廣東醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東 湛江 524001)

研究論文

AZD8055抑制肝癌huh7細(xì)胞增殖和促細(xì)胞凋亡

李 鵬，王亞紅，楊拉維，楊 騰，何香紅，黃海麗*

(廣東醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東 湛江 524001)

目的探討AZD8055對肝癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響及其分子機(jī)制。方法肝癌細(xì)胞系huh7隨機(jī)分為對照組(DMSO)和加藥組(AZD8055)，MTT法檢測huh7細(xì)胞增殖，平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞克隆形成能力，AnexinV/FITC雙染法檢測細(xì)胞凋亡率，免疫印跡法檢測AMPK蛋白表達(dá)和磷酸化水平。結(jié)果AZD8055抑制肝癌細(xì)胞的增殖呈濃度和時(shí)間依賴性(Plt;0.05)。AZD8055處理導(dǎo)致肝癌細(xì)胞克隆數(shù)目減少以及誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡(Plt;0.05)。AZD8055處理引起AMPK蛋白磷酸化水平上升，但對總蛋白表達(dá)水平影響不大。AMPK蛋白抑制劑Dorsomorphin通過抑制AMPK蛋白磷酸化水平而降低AZD8055對肝癌細(xì)胞的抑制作用。結(jié)論AZD8055可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，并且主要通過調(diào)節(jié)AMPK蛋白的磷酸化水平實(shí)現(xiàn)其對增殖的抑制作用。

AZD8055；肝癌；AMPK；增殖

AZD8055 是一種特異有效的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)激酶抑制劑，它可以有效抑制mTORC1和mTORC2的活性[1- 2]。AZD8055與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(又稱AZD6224)協(xié)同作用，通過抑制MAPK和AKT/mTOR信號通路,從而提高非小細(xì)胞肺癌以及結(jié)腸直腸癌腫瘤細(xì)胞的凋亡率和生長抑制率[3]。AZD8055可以抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7、骨肉瘤細(xì)胞U2OS、人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG的增殖。它主要通過抑制mTORC1和mTORC2的活性以及其下游的通路關(guān)鍵蛋白的活化實(shí)現(xiàn)對這些腫瘤細(xì)胞的抑制作用[4]。另外，還有研究表明,AZD8055對宮頸癌、急性淋巴白血病等腫瘤細(xì)胞均有抑制作用[2,5]。這些研究均顯示了AZD8055作為化療藥物治療腫瘤的潛力[6- 7]。

單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是一個(gè)細(xì)胞能量狀態(tài)的生物感應(yīng)器，已被證明對于腫瘤細(xì)胞的生長、代謝、凋亡和自噬具有調(diào)節(jié)作用[8]。AMPK對于腫瘤細(xì)胞具有雙重調(diào)節(jié)作用。AMPK通過間接調(diào)節(jié)NADPH促進(jìn)癌細(xì)胞的生存[9- 10]。AMPK還可以調(diào)控癌細(xì)胞代謝，并限制癌細(xì)胞生長[11]。另外，AMPK在已知的腫瘤抑制基因的上游和下游發(fā)揮作用[8,12]。由于AMPK信號通路在腫瘤生長代謝等方面具有重要作用，本研究在探討AZD8055對肝癌細(xì)胞增殖抑制作用的分子機(jī)制時(shí)，將重點(diǎn)放在AMPK信號通路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：huh7細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)保存。

1.1.2 主要試劑：AZD8055(Selleck Chemicals公司)，AMPK抑制劑(dorsomorphin)、噻唑鹽MTT和二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)，兔抗人p-AMPK和兔抗人AMPK抗體(Cell Signaling Technology公司)，兔抗人Actin(Santa Cruze Biotechnology公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(武漢博士德生物)，PVDF膜(Millipore公司)，Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒(BD公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清(Life technology公司)，BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將huh7細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清1640 培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)增殖期細(xì)胞接種于96 孔板, 每孔200 μL濃度為1×107cells/L, 過夜培養(yǎng)等細(xì)胞貼壁后加入不同劑量梯度(5、10、20、50和100 nmol/L)和不同作用時(shí)間(12、24、36、48和72 h)的AZD8055試劑，對照組加入等體積的DMSO試劑，分別處理huh7細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)平行孔。實(shí)驗(yàn)終止前4 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，培養(yǎng)結(jié)束后小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入DMSO 150 μL，完全顯色后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490 nm波長測定各孔光吸收值。按公式計(jì)算AZD8055對huh7細(xì)胞的生長抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A490值/對照組A490值)×100%

1.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期的huh7細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后吹打成單個(gè)懸浮細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后以每孔150個(gè)/mL細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，每個(gè)平行設(shè)2個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，按照100 nmol/L AZD8055進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理(DMSO組作為陰性對照組)，置37 ℃、5% CO2及飽和濕度環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2周，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去上清液，用PBS小心漂洗2次，甲醇固定，然后進(jìn)行結(jié)晶紫活細(xì)胞染色30 min，用流水緩慢漂洗去除染色液，自然風(fēng)干。觀察細(xì)胞克隆形成。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板, 每孔2 mL濃度為2×108cells/L, 過夜培養(yǎng)等細(xì)胞貼壁后加入100 nmol/L的AZD8055，對照組加入等體積DMSO，分組處理huh7細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞樣品，PBS洗滌。按 Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書處理細(xì)胞樣品，上機(jī)檢測。

1.2.5 Western blot檢測p-AMPK、AMPK蛋白表達(dá)量的變化：取對數(shù)生長期huh7細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，換含2%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)10～12 h，加入100 nmol/L AZD8055作用不同時(shí)間梯度(0、6、12和24 h)，或預(yù)先加入AMPK抑制劑2 mmol/L dorsomorphin處理2 h再加入100 nmol/L AZD8055作用12 h，對照組加入等體積的二甲基亞砜(DMSO)。收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌1次，蛋白裂解液(RIPA)裂解細(xì)胞，離心收集上清液即為總蛋白溶液。BCA法測定蛋白含量，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后將膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，再將膜置于5%脫脂奶粉的TBST封閉液中封閉1 h，一抗孵育4 ℃過夜，TBST洗膜，用相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗常溫孵育1 h，TBST 洗膜后，ECL顯色發(fā)光檢測相應(yīng)條帶。β-actin 作為內(nèi)參照。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

1.2.6 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力：按照預(yù)定的實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，采用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色并細(xì)胞計(jì)數(shù)，死細(xì)胞為藍(lán)紫色，活細(xì)胞為透明色，重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算細(xì)胞活力抑制率。活細(xì)胞率(%)= 活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%

2 結(jié)果

2.1 AZD8055對huh7細(xì)胞增殖的抑制作用

AZD8055抑制huh7細(xì)胞的增殖并呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴性(圖1)。

2.2AZD8055對huh7細(xì)胞克隆形成能力的影響

AZD8055抑制huh7細(xì)胞克隆形成能力(圖2)。

2.3 AZD8055對huh7細(xì)胞凋亡的影響

和對照組相比，AZD8055(100 nmol/L)處理huh7細(xì)胞24和48 h后，凋亡率有明顯上升，其中早期凋亡率分別達(dá)到13.0%和19.0%，晚期凋亡率分別達(dá)到15.6%和22.5%(Plt;0.05)(圖3)。

2.4AZD8055抑制huh7細(xì)胞增殖通過激活A(yù)MPK活性

100 nmol/L AZD8055引起了AMPK蛋白磷酸化水平的升高并在24 h時(shí)達(dá)到最高水平(圖4A)，而預(yù)先加入AMPK抑制劑dorsomorphin處理 2 h再加入100 nmol/L AZD8055處理，減弱了AMPK蛋白磷酸化水平的升高(圖4B)。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)加入AMPK抑制劑dorsomorphin減弱了AZD8055對huh7細(xì)胞凋亡的影響(圖4C)。

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with control 圖1 AZD8055對huh7細(xì)胞增殖的抑制作用Fig 1 The proliferation inhibition by AZD8055 on huh7 cells

*Plt;0.01 compared with control圖2 AZD8055抑制huh7細(xì)胞克隆形成Fig 2 AZD8055 suppresses colony formation of huh7 cells

*Plt;0.05 compared with control 圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡Fig 3 Apoptosis analyzed by flow cytometry

A.AZD8055 increased p-AMPK expression without changing AMPK expression; B.AMPK inhibitor dorsomorphin compromised AZD8055-induced up-regulation of p-AMPK; C.death rate of huh7 following different treatment; *Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with control; #Plt;0.05 compared with or without dorsomorphin圖4 AZD8055抑制huh7細(xì)胞增殖通過激活A(yù)MPK活性Fig 4 Role of AMPK activation in AZD8055-induced huh7 cells death

3 討論

肝癌是中國死亡率最高的癌癥之一。目前中國肝癌的治療手段以手術(shù)為主，而不能手術(shù)的患者則以化療為主。目前常用的化療藥物存在著易產(chǎn)生耐藥性、腫瘤殺傷效率不高等局限，因此迫切需要開發(fā)新的有效藥物治療肝癌。

AZD8055是一種特異有效的mTOR抑制劑[1,4]。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，它對于肺癌、乳腺癌、大腸癌和黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞的增殖能力均有抑制作用[2- 3]。本實(shí)驗(yàn)主要研究其對肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成能力的影響以及相關(guān)分子機(jī)制。本結(jié)果顯示AZD8055可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，并且這種抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴性。另外，AZD8055還可以抑制肝癌細(xì)胞的克隆形成能力，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此推測AZD8055通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡從而抑制其增殖。

單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated potein kinase，AMPK)具有細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器的功能，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷代謝應(yīng)激反應(yīng)時(shí)(例如化療藥物的刺激)，伴隨著細(xì)胞內(nèi)AMP水平或AMP與ATP的比例升高，AMPK被AMP激活，其活化的結(jié)果導(dǎo)致脂肪酸氧化的增加以產(chǎn)生更多ATP；同時(shí)抑制ATP消耗，幫助細(xì)胞度過急性損傷，暫時(shí)保障細(xì)胞的存活[9,13]。前人研究表明，AMPK通路對于化療后腫瘤細(xì)胞的生存具有關(guān)鍵作用，它可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝以及生長速度[14]。本研究發(fā)現(xiàn)AZD8055處理引起肝癌細(xì)胞激活A(yù)MPK信號通路，AMPK蛋白磷酸化水平升高。而抑制AMPK信號通路的激活則可部分扭轉(zhuǎn)AZD8055對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用。這些結(jié)果表明AZD8055通過激活A(yù)MPK通路從而調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，AZD8055可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，其對肝癌細(xì)胞的抑制作用主要是通過調(diào)節(jié)AMPK信號通路的活化來實(shí)現(xiàn)的。這為應(yīng)用AZD8055治療肝癌提供了理論依據(jù)。

[1] Pike KG, Malagu K, Hummersone MG,etal. Optimization of potent and selective dual mTORC1 and mTORC2 inhibitors: the discovery of AZD8055 and AZD2014[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2013, 23: 1212- 1216.

[2] Willems L, Chapuis N, Puissant A,etal. The dual mTORC1 and mTORC2 inhibitor AZD8055 has anti-tumor activity in acute myeloid leukemia[J]. Leukemia, 2012, 26: 1195- 1202.

[3] Holt SV, Logie A, Davies BR,etal. Enhanced apoptosis and tumor growth suppression elicited by combination of MEK (selumetinib) and mTOR kinase inhibitors (AZD8055)[J]. Cancer Res, 2012, 72: 1804- 1813.

[4] Chresta CM, Davies BR, Hickson I,etal. AZD8055 is a potent, selective, and orally bioavailable ATP-competitive mammalian target of rapamycin kinase inhibitor withinvitroandinvivoantitumor activity[J]. Cancer Res, 2010, 70: 288- 298.

[5] Li S, Li Y, Hu R,etal. The mTOR inhibitor AZD8055 inhibits proliferation and glycolysis in cervical cancer cells[J]. Oncol Lett, 2013, 5: 717- 721.

[6] Asahina H, Nokihara H, Yamamoto N,etal. Safety and tolerability of AZD8055 in Japanese patients with advanced solid tumors; a dose-finding phase I study[J]. Invest New Drugs, 2013, 31: 677- 684.

[7] Houghton PJ, Gorlick R, Kolb EA,etal. Initial testing (stage 1) of the mTOR kinase inhibitor AZD8055 by the pediatric preclinical testing program[J]. Pediatr Blood Cancer, 2012, 58: 191- 199.

[8] Fruman DA, Edinger AL. Cancer therapy: staying current with AMPK[J]. Biochem J, 2008, 412: 3- 5.

[9] Jeon SM, Chandel NS, Hay N. AMPK regulates NADPH homeostasis to promote tumour cell survival during energy stress[J]. Nature, 2012, 485: 661- 665.

[10] She C, Zhu LQ, Zhen YF,etal. Activation of AMPK protects against hydrogen peroxide-induced osteoblast apoptosis through autophagy induction and NADPH maintenance: new implications for osteonecrosis treatment?[J]. Cell Signal, 2014, 26: 1- 8.

[11] Faubert B, Boily G, Izreig S,etal. AMPK is a negative regulator of the Warburg effect and suppresses tumor growthinvivo[J]. Cell Metab, 2013, 17: 113- 124.

[12] Han D, Li SJ, Zhu YT,etal. LKB1/AMPK/mTOR signaling pathway in non-small-cell lung cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14: 4033- 4039.

[13] Chen L, Han F, Qu H,etal. Combination therapy with 5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside and arsenic trioxide in acute myeloid leukemia cells involving AMPK/TSC2/mTOR pathway[J]. Pharmazie, 2013, 68: 117- 123.

[14] Storozhuk Y, Hopmans SN, Sanli T,etal. Metformin inhibits growth and enhances radiation response of non-small cell lung cancer (NSCLC) through ATM and AMPK[J]. Br J Cancer, 2013, 108: 2021- 2032.

AZD8055 inhibits proliferation andinduces apoptosis of hepatocellular carcinoma huh7 cells

LI Peng, WANG Ya-hong, YANG La-wei, YANG Teng, HE Xiang-hong, HUANG Hai-li*

(Clinical Research Center, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China)

ObjectiveTo investigate effects of AZD8055 on proliferation and colony formation of hepatocellular carcinoma cells.MethodsThe huh7 cells were divided into two groups: control group (DMSO) and AZD8055 group. MTT assay and colony formation assay were performed to detect effects of AZD8055 on proliferation and colony formation of hepatocellular carcinoma cells respectively. Apoptosis rate was assessed by performing AnexinV/FITC double staining. Western blot was performed to detect AMPK and p-AMPK expression.ResultsAZD8055 inhibited proliferation of huh7 cells in a time- and concentration-dependent manner (Plt;0.05). AZD8055 treatment reduced colony numbers of huh7 cells and induced apoptosis compared to those untreated cells (Plt;0.05). AZD8055 treatment increased p-AMPK expression but didn’t change AMPK expression. Blocking AMPK activation by using AMPK inhibitor Dorsomorphin partially reversed proliferation inhibition induced by AZD8055.ConclusionsAZD8055 inhibits proliferation and colony formation of huh7 cells through AMPK signaling pathway.

AZD8055; hepatocellular carcinoma; AMPK; proliferation

2013- 12- 24

2014- 03- 24

廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目(S2012040006537)；廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院博士科研基金(BK201202)；廣東醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)項(xiàng)目(XB1224)

*通信作者(correspondingauthor)：huanghaili2013@126.com

1001-6325(2014)06-0771-05

R73-36+2

A