利用流式細(xì)胞術(shù)檢測LPS刺激活化后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體積的變化

劉 音,劉 碩，王文蝶，朱 軍，陳朱波，姜明紅

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室, 北京 100005)

研究論文

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測LPS刺激活化后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體積的變化

劉 音,劉 碩，王文蝶，朱 軍，陳朱波，姜明紅*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室, 北京 100005)

目的探討小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)脂多糖(LPS)刺激活化后體積的變化。方法LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞3和24 h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，用ELISA法檢測細(xì)胞上清中IL-6的含量，用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測細(xì)胞活化后的體積。結(jié)果小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在正常狀態(tài)下呈圓型，細(xì)胞邊緣光滑無偽足，胞質(zhì)內(nèi)無空泡。經(jīng)LPS刺激3 h后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的表面積變大，伸出偽足，偽足的數(shù)量和長度隨時間延長而逐漸增多和增長，胞質(zhì)內(nèi)的空泡也逐漸增加； 24 h后，細(xì)胞表面積明顯增大，偽足牽拉使細(xì)胞形狀呈梭型。LPS處理后細(xì)胞上清中IL-6的含量較對照組顯著增加(Plt;0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的前向角散射光(FSC)的數(shù)值(代表細(xì)胞大小)隨LPS刺激時間的延長而增加，3和24 h分別增加了11.0%(Plt;0.05)和20.2%(Plt;0.01)；側(cè)向角散射光(SSC)的數(shù)值(代表表面顆粒數(shù))也逐漸增加，3和24 h分別增加了21.6% (Plt;0.05)和68.0% (Plt;0.01)。結(jié)論流式細(xì)胞術(shù)可以定量檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS活化后的體積變化，為天然免疫細(xì)胞的活化研究提供了新的檢測手段。

LPS；巨噬細(xì)胞；活化；流式細(xì)胞術(shù)

巨噬細(xì)胞是重要的天然免疫細(xì)胞，具有吞噬清除異物、加工提呈抗原和合成分泌細(xì)胞因子等生物學(xué)功能，參與維持機體正常的生理和病理狀態(tài)[1]。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能夠激活巨噬細(xì)胞表面Toll樣受體(Toll-like recepter 4，TLR4)[2]，從而觸發(fā)一系列下游信號通路，產(chǎn)生炎性因子,發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。以往對巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的研究主要借助于光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的吞噬功能，而利用流式細(xì)胞術(shù)和雙光子熒光顯微鏡則能夠更準(zhǔn)確地觀察和評價巨噬細(xì)胞的吞噬過程和能力[3]。但是，在巨噬細(xì)胞受LPS刺激的活化過程中，巨噬細(xì)胞的體積是否發(fā)生了變化，這種變化對細(xì)胞內(nèi)免疫信號通路的傳遞有什么意義，目前鮮有報道。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在LPS刺激后的體積變化，為天然免疫細(xì)胞對病原體的防御機制研究提供新的思路和手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級C57BL/6J近交系雄性小鼠，，8周齡，體質(zhì)量20～25 g(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，NO.11400500001308)，在室溫18～22 ℃ 和相對濕度為65%～75%的SPF級屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS；Escherichia coli 0111:B4)(Sigma公司)。ELISA試劑盒(Ramp;D公司)

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng)：常規(guī)方法收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞[4]，以5×105/孔接種于12孔培養(yǎng)板中，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后換液，棄去未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

1.2.2 光鏡觀察小鼠腹腔巨噬細(xì)胞形態(tài)變化：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞接種于12孔板， 24 h后加入100 ng/mL的LPS刺激，3和24 h分別在光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3 ELISA方法檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清中IL-6的含量：經(jīng)LPS刺激0、3、8和24 h后，收集細(xì)胞上清，按照說明書測定IL-6的含量。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體積變化：用LPS分別刺激3和24 h后，收集孔內(nèi)細(xì)胞，PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，使用流式細(xì)胞儀檢測。在流式細(xì)胞儀(BD-AriaII)的散點圖上調(diào)整圈定巨噬細(xì)胞群，比較未處理組(對照組)與LPS刺激不同時間點組(實驗組)前向角散射光(forward scatter,FSC)與側(cè)向角散射光(side scatter,SSC)數(shù)值的變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均經(jīng)過3次以上重復(fù)實驗，SPSS15.0軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析。

*Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with control(0 hour)圖1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后細(xì)胞上清中的IL-6含量變化Fig 1 The change of IL-6 level in supernatant of LPS- induced mouse peritoneal macrophages

2 結(jié)果

2.1 LPS處理后巨噬細(xì)胞分泌IL-6的水平

經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞上清中IL-6的含量在3 h有所增加 (Plt;0.05)，8 h顯著增加(Plt;0.01)，24較8 h相對減少，但仍顯著高于未刺激組(0 h)(Plt;0.01)(圖1)。

2.2 LPS處理后巨噬細(xì)胞形態(tài)的變化

LPS處理3 h后，光鏡下觀察到未處理組的細(xì)胞大小均勻，呈圓形，中間凹陷，邊緣突起，具有明顯的立體結(jié)構(gòu)，邊緣光滑整齊。處理組3 h后，細(xì)胞變大，大小不均一，伸出很多偽足，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)很多空泡。處理24 h后，細(xì)胞表面積變得更大，偽足牽拉細(xì)胞使細(xì)胞呈梭型，細(xì)胞間的偽足相互融合，細(xì)胞邊界不清晰。細(xì)胞扁平，缺乏立體結(jié)構(gòu)(圖2)。

2.3 LPS處理后巨噬細(xì)胞體積的變化

LPS處理3和24 h，隨著刺激時間的延長，F(xiàn)SC值較未處理組顯著增加 (Plt;0.01)。SSC值在3和24 h也隨著LPS刺激時間的延長(Plt;0.01)，細(xì)胞表面的顆粒數(shù)明顯增加，24 h增加最為顯著(圖3，表1)。

A.control；B.LPS stimulation 3 hours；C.LPS stimulation 24 hours圖2 光鏡下觀察小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后不同時間點細(xì)胞形態(tài)的變化

A.control；B.LPS stimulation 3 hours；C.LPS stimulation 24 hours圖3 LPS處理后不同時間點小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體積及表面顆粒數(shù)的變化

LPSstimulation(hours)FSC-ASSC-Adatapercentageincrease(%)datapercentageincrease(%)098276 -71474 -3109117 11.0*86887 21.6*24118135 20.2**120057 68.0**

*Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with control (0 hour).

3 討論

天然免疫系統(tǒng)是機體抵御病原體入侵的第一道防線，天然免疫系統(tǒng)由物理屏障、天然免疫細(xì)胞和天然免疫分子組成。巨噬細(xì)胞屬于天然免疫細(xì)胞，具有抗原提呈功能，在天然免疫和適應(yīng)性免疫中起橋梁作用。巨噬細(xì)胞在受到病原體侵襲后，能夠通過表面或胞內(nèi)的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)識別病原體相關(guān)分子模式，從而激活下游信號通路，產(chǎn)生炎性因子等，發(fā)揮其抗病原體的能力[4]。以往對巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)的研究，多采用光學(xué)顯微鏡或是熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，或結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面分子的變化[5- 6]，但對于其受到病原體刺激后的形態(tài)學(xué)及體積變化尚缺乏詳細(xì)的報道。長期以來由于技術(shù)原因，一直沒有比較精確且能大量測定細(xì)胞體積的方法。傳統(tǒng)的細(xì)胞的體積檢測方法為同位素?fù)饺牒偷鞍缀繙y定等，但這些方法具有同位素污染等弊端，操作非常不便。隨著流式細(xì)胞儀的普遍應(yīng)用和檢測技術(shù)的日臻成熟，本研究試圖利用該技術(shù)為檢測細(xì)胞體積變化提供一種快捷、穩(wěn)定、重復(fù)性好和成本低廉的方法。

本研究利用LPS刺激巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清中IL-6水平顯著增加，說明LPS激活了巨噬細(xì)胞的炎性因子信號通路，提示該細(xì)胞處于活化狀態(tài)。利用光學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)LPS刺激后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的空泡增多，伸出數(shù)個偽足，細(xì)胞表面積明顯增大，具明顯的時間依賴性關(guān)系，即刺激時間越長，細(xì)胞表面積越大，但無法判斷細(xì)胞體積是否增大。流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果證實，細(xì)胞經(jīng)LPS處理后FSC數(shù)值增大，與SSC數(shù)值呈正相關(guān)關(guān)系，說明細(xì)胞表面顆粒數(shù)增多的同時，細(xì)胞體積也增大，與LPS的刺激時間成明顯的依賴關(guān)系，說明利用流式細(xì)胞術(shù)可以定量地測定細(xì)胞活化后的體積變化。而當(dāng)巨噬細(xì)胞的體積在LPS刺激后顯著增大后，細(xì)胞內(nèi)多種重要分子的表達(dá)水平發(fā)生了劇烈地變化，除了為增強天然免疫的信號通路外，可能也是為了維持其在細(xì)胞內(nèi)的分子濃度，以完成正常的細(xì)胞生命活動及重要的生化反應(yīng)。通過測定細(xì)胞的體積變化，更有助于理解了天然免疫細(xì)胞的分子防御機制。

本研究證明流式細(xì)胞術(shù)能夠檢測細(xì)胞的體積變化，為判斷天然免疫細(xì)胞的活化狀態(tài)提供了一種簡單實用的檢測方法，也為信號通路的機制研究提供新的輔助手段。同時，細(xì)胞體積也有可能成為天然免疫細(xì)胞研究的重要參數(shù)。

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Determination of volume change ofLPS-stimulated mouse peritoneal macrophages by flow cytometry

LIU Yin, LIU Shuo, WANG Wen-die, ZHU Jun, CHEN Zhu-bo, JIANG Ming-hong*

(Dept. of Immunology, National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo determine the volume change of mouse peritoneal macrophages after LPS-stimulation.MethodsAfter stimulation with LPS for 3 and 24 hours, the cell morphological changes were observed under phase-contrast microscope, the content of IL-6 in the cell supernatant was measured with ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), and the volume changes were analyzed with flow cytometry, respectively.ResultsIn normal condition, mouse peritoneal macrophages are round with smooth edge and without vacuoles. After stimulated by LPS, the surface area of mouse peritoneal macrophages become larger than before. Pseudopodium and vacuoles can also be seen and as stimulation time extended, their number increased. Especially after 24 hours, mouse peritoneal macrophages turned into fusiform, and their pseudopodia fused with each other. After LPS stimulation, the content of IL-6 in the cell supernatant dramatically increased, illustrating the secretory pathway of inflammatory factor has been activated by LPS and the peritoneal macrophages have been activated. Flow cytometry observed increasing FSC (demonstrating cell

size) by 11.0% (Plt;0.05) after 3 hours and 20.2% (Plt;0.01) after 24 hours, as well as SSC (demonstrating paticles in cell surface) increased by 21.6% (Plt;0.05) after 3 hours and 68.0% (Plt;0.01) after 24 hours.ConclusionsFlow cytometry can determine the volume changes of mouse peritoneal macrophages quantitatively, providing new method for studying the activation and function of innate immunity cells.

LPS；macrophage；activation；flow cytometry

2014- 01- 13

2014- 04- 16

國家(重點)實驗室專項經(jīng)費(2060204)

*通信作者(correspondingauthor)：jiangminghong@163.com

1001-6325(2014)06-0767-04

R 392-33

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