42℃熱處理在UVB誘導黑素細胞氧化損傷中的作用

胡文治 祃麗娟 趙廣

42℃熱處理在UVB誘導黑素細胞氧化損傷中的作用

胡文治 祃麗娟 趙廣

目的探討熱處理在UVB誘導的人黑素細胞氧化應激損傷中的作用。方法體外培養(yǎng)原代人表皮黑素細胞,將純化的MC分為4個處理組：對照組(37℃正常培養(yǎng))、熱處理組(42℃孵育1 h)、UVB處理組(100 mJ/cm2UVB照射)、聯(lián)合處理組(42℃孵育1 h后給予100 mJ/cm2UVB照射),各組連續(xù)處理3 d。MTT法檢測細胞活率,生物化學法檢測超氧化物歧化酶活力和丙二醛濃度,流式細胞儀檢測細胞內活性氧和細胞凋亡率。結果對照組細胞活率、細胞凋亡率、超氧化物歧化酶活力、丙二醛濃度、活性氧熒光強度分別為：(100 ± 6.14)%、(4.66 ± 0.58)%、(53.39 ± 8.23)U/gprot、(1.09 ± 0.32)mmol/gprot、1070.85 ± 42.07。 UVB 照射可以明顯提高MC凋亡率[(24.14±2.90)%]、丙二醛[(1.65±0.33)mmol/gprot]和細胞內活性氧(1416.45±79.12)水平,降低細胞活率[(50.23±5.36)%]和超氧化物歧化酶活力[(31.98±11.89)U/gprot],而熱處理可以顯著降低UVB誘導的凋亡[(14.9±1.49)%],降低丙二醛[(1.10±0.26)mmol/gprot]、活性氧(1033.30±68.41)的含量,同時恢復細胞的活率[(74.12±6.17)%)]和超氧化物歧化酶活力[(51.63±6.55)U/gprot]。結論熱處理對UVB誘導的黑素細胞的氧化應激損傷具有保護作用。

黑素細胞;熱;中波紫外線;氧化性應激

白癜風是一種進行性色素脫失性疾病,其主要的病理特征為表皮功能性黑素細胞(melanocytes,MC)的破壞和缺失。治療手段包括：紫外線、308 nm準分子激光、局部外用免疫調節(jié)劑或維生素D衍生物等。其中,窄譜中波紫外線(NB-UVB)局部照射是有效的治療方法之一。但是,有研究表明,紫外線照射,特別是UVB(290～320 nm),可以誘導組織產生自由基和相關的活性氧,直接損傷DNA,最終導致皮膚老化和皮膚癌[1]。多項研究發(fā)現(xiàn),白癜風患者MC存在抗氧化功能的缺陷[2],提示我們用UVB治療白癜風,必須要考慮到過量UVB對MC的損傷。另一方面,有研究證實,熱照射也可以應用于白癜風治療。Nakazawa等[3]首次比較了人表皮MC對UVB和熱的反應,發(fā)現(xiàn)熱照射可以促使MC樹突增多延長、胞體增大,細胞酪氨酸酶活性和黑素合成增加。研究還提示,適量的熱處理可以減少外部環(huán)境對細胞的損傷。我們通過檢測人表皮MC在體外環(huán)境下的活率、凋亡率、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)濃度、細胞內活性氧(ROS),分析熱處理、UVB照射、聯(lián)合處理對細胞的影響。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑與儀器：黑素細胞培養(yǎng)基(M-254)、黑素細胞生長添加物(HMGS-1)產自美國Gibco公司;真表皮分散酶產自美國Roche公司;噻唑藍(MTT)、2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)產自美國Sigma公司;FITC Annexin V Apoptosis試劑盒產自美國BD公司;胎牛血清產自杭州天杭生物公司;胰蛋白酶消化液產自南京凱基生物公司;SOD、MDA、蛋白定量試劑盒產自南京建成生物工程研究所。紫外線光療儀產自上海希格瑪高科技有限公司(光源波長310～313 nm,峰值311 nm);UVB輻照儀由北京師范大學光電儀器廠生產;BX60熒光顯微鏡由日本Olympus公司生產。

二、方法

1.人黑素細胞的培養(yǎng)和傳代：取成人包皮環(huán)切后標本,碘伏浸泡消毒10 min,清除皮下組織,剪切為0.5 cm×0.5 cm皮片。置于0.5%真表皮分散酶中,4℃靜置12 h,37℃消化1 h。分離真表皮,將表皮置于胰蛋白酶內室溫消化20 min,胎牛血清終止消化,吹打為單細胞懸液,200目細胞篩過濾。離心后加入M-254培養(yǎng)液,接種于培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱培養(yǎng),待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶后進行傳代。經傳代獲得純化的黑素細胞培養(yǎng)系,傳至3～5代收獲細胞備用。

2.實驗分組：3～5代MC長至80%融合時,胰蛋白酶消化收集。根據(jù)不同實驗需要,以不同密度接種于培養(yǎng)皿。細胞活率實驗：96孔板,2 000/孔;細胞凋亡實驗：35 mm培養(yǎng)皿,1×105/孔;MDA濃度、SOD活力檢測：100 mm培養(yǎng)皿,密度8×105/孔;細胞內ROS檢測：60 mm培養(yǎng)皿,密度3×105/孔。待細胞長至70%融合,更換培養(yǎng)液,隨機分為對照組、熱處理組、UVB處理組、聯(lián)合處理組,每組6個樣本,重復3次。

3.細胞干預方法：UVB處理組：超凈臺內,紫外線治療儀以0.64 mW/cm2照射強度UVB照射156 s(照射劑量100 mJ/cm2)。為避免培養(yǎng)基顏色的影響,照射時根據(jù)培養(yǎng)皿面積,以25 μl/cm2PBS替換培養(yǎng)基,照射后重新添加培養(yǎng)基(非UVB處理組,以等量PBS處理相同時間)。熱處理：42℃、5%CO2、飽和濕度孵箱內培養(yǎng)1 h。聯(lián)合處理組：熱處理后給予UVB處理。對照組：37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱內培養(yǎng),不做任何處理。各組連續(xù)干預3 d,每天干預1次,末次處理12 h后檢測各項指標。

4.不同處理對MC活率的影響：將處理后的96孔板,置于超凈臺內。每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl,37℃孵育4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入 150 μl DMSO充分溶解結晶物,將不同處理組DMSO移入同一96孔板,酶標儀490 nm波長進行比色,以空白孔調零,細胞活率 =A處理組/A對照組×100%。

5.不同處理對細胞凋亡的影響：胰蛋白酶消化收集各處理組細胞。按照FITC Annexin V Apoptosis試劑盒說明書操作,將消化細胞用預冷PBS漂洗2遍后,用適量結合緩沖液[0.01 mol/L Hepes/NaOH(pH 7.4),0.14 mol/L NaCl,2.5 mmol/L CaCl2]重懸細胞,將細胞密度調整至1×106/ml。取100 μl細胞懸液移至上樣管,每管加Annexin V和PI各5 μl。室溫避光孵育15 min后,每管加300 μl結合緩存液,立即上機檢測。

6.檢測不同處理組SOD活力和MDA濃度：胰蛋白酶消化并收集各處理組細胞,加入預冷PBS漂洗1遍,加入0.5 ml PBS將細胞吹打為細胞懸液,在冰浴器上用超聲裂解細胞(60 W,0.5 s間隔,15 min)。4℃下,10 000×g離心15 min,將上清液移入新試管中。測量樣本蛋白濃度：取樣品上清適當稀釋后,參考試劑盒說明書,用BCA法測定總蛋白量。測量MDA：取樣品上清,參考試劑盒說明書,應用硫代巴比妥(TBA)法,測定MDA含量。測量SOD活力：取樣品上清,適當稀釋后,參考試劑盒說明,應用WST-1法測定樣品SOD活力。

7.細胞內ROS測定：各處理組棄去培養(yǎng)基,加入不含添加因子的M-254培養(yǎng)基,加入DCFH-DH使終濃度達到2.5 μmol/l,37℃孵育細胞30 min。取部分樣本,經熒光顯微鏡488 nm波長藍光激發(fā)綠色熒光,軟件采集圖像。剩余樣本經胰蛋白酶消化收集細胞,加入200 μl的PBS吹打為細胞懸液。應用流式細胞儀檢測10 000個細胞的平均熒光強度,應用CELL QuestTM軟件分析。

8.統(tǒng)計學分析：用SPSS16.0進行統(tǒng)計學分析,所有數(shù)據(jù)以±s表示。對各組數(shù)據(jù)進行方差分析和LSD-t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.黑素細胞活率：MTT實驗顯示,對照組、熱處理組、UVB處理組、聯(lián)合處理組的活率分別為(%)：100 ± 6.14、105.85 ± 5.32、50.23 ± 5.36、74.12 ± 6.17。統(tǒng)計分析顯示,熱處理可以促進MC的增殖(P＜0.01),UVB處理組和聯(lián)合處理組MC活率均顯著降低(P＜0.01),但聯(lián)合處理組活率明顯高于UVB組(P＜0.01)。

2.黑素細胞凋亡率：對照組、熱處理組、UVB處理組、聯(lián)合處理組MC的凋亡率(%)分別為：4.66±0.58、8.87 ± 1.67、24.14 ± 2.90、14.9 ± 1.49,3 個處理組凋亡率均高于對照組(P＜0.001),但較熱處理組和聯(lián)合干預組,UVB處理組凋亡率明顯增高(P＜0.001),見圖 1。

3.黑素細胞SOD活力和MDA濃度：UVB處理組,較其他3組SOD活力明顯降低(均P＜0.01),MDA濃度明顯增高(均P＜0.01);對照組、熱處理組、聯(lián)合處理組間SOD活力與MDA濃度,差異均無統(tǒng)計學意義,見表1。

表1 不同處理組黑素細胞SOD活力和MDA濃度(±s,n=6)

表1 不同處理組黑素細胞SOD活力和MDA濃度(±s,n=6)

注：a：與其他3個組相比,均P＜0.01

SOD(U/gprot) MDA(mmol/gprot)對照組 53.39±8.23 1.09±0.32熱處理組 44.45±6.66 0.85±0.08 UVB處理組 31.98±11.89a 1.65±0.33a聯(lián)合處理組 51.63±6.55 1.10±0.26

4.細胞內ROS：熒光顯微鏡下,UVB處理組綠色熒光明顯增強。流式細胞儀檢測顯示：對照組、熱處理組、UVB處理組、聯(lián)合處理組熒光強度分別為：1 070.85 ± 42.07、1 101.90 ± 44.99、1 416.45 ± 79.12、1 033.30±68.41。UVB處理組平均熒光強度明顯高于其他3個組(均P＜0.01),對照組、熱處理組、聯(lián)合處理組之間,差異無統(tǒng)計學意義,見圖2。

討 論

在MC的體外實驗中,有學者發(fā)現(xiàn)熱處理(42℃,60 min,連續(xù)3 d)可以促進MC增殖,增強酪氨酸酶活性和黑素合成[4]。祃麗娟等[5]通過角質形成細胞(keratinocytes,KC)與MC的共培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn),熱處理后MC與KC α-MSH分泌增加,MSH前體POMC基因表達水平上升。這些研究都提示,熱處理可以提高MC活性及功能。不僅如此,其他研究發(fā)現(xiàn),熱處理聯(lián)合UVB照射,可以增加UVB的治療效果,促進MC內酪氨酸酶活性,增加黑素合成[6],邵麗芳等[7]發(fā)現(xiàn),熱處理聯(lián)合UVB照射,可以引起細胞HSP72水平增高,提示熱處理可能對UVB誘導的損傷具有保護作用。鑒于以上研究,我們針對不同處理方法對MC的影響進行了觀察。

圖1 不同處理對細胞凋亡的影響 Annexin V、PI雙標法檢測細胞凋亡,流式細胞儀計數(shù),圖中左下象限為正常細胞,左上象限為壞死細胞,右下象限為早凋細胞,右上象限為晚凋細胞。其中熱處理組、UVB組、聯(lián)合處理組細胞凋亡率均高于對照組,但熱處理組和聯(lián)合處理組凋亡率均低于UVB組

圖2 不同處理對細胞內ROS的影響 不同處理組DCFH-DH(2.5 μmol/l)孵育30 min后,胞質內呈黃綠色熒光(熒光顯微鏡,×200)。圖中細胞熒光強度反應細胞內ROS水平,結果顯示UVB處理組熒光強度明顯高于其他3個組

實驗中我們觀察到,MC活率隨UVB照射劑量的增加而減低,當UVB照射劑量大于50 mJ/cm2連續(xù)3 d時,MC的活率受到明顯抑制(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。當UVB照射達到100 mJ/cm2連續(xù)3 d時,為MC的半效抑制劑量,此時MC的凋亡率明顯增加,細胞內SOD活力明顯減低,細胞內ROS累積,并引發(fā)脂質過氧化作用,導致脂質過氧化物(MDA)濃度的顯著增加。研究顯示,UVB可以通過多種途徑對細胞造成損傷,特別是產生過量的ROS誘導細胞氧化損傷。ROS具有調節(jié)生長、損傷應答等多種功能,但過量ROS會導致明顯的毒副作用,諸如蛋白失活、誘導凋亡、損傷細胞核和線粒體DNA、促進炎性介質釋放。UV照射不僅可以活化核黃素、色氨酸、卟啉等小分子產生ROS[8],還可以損傷線粒體,加速氧化失衡。線粒體在氧化損傷中發(fā)揮重要作用,線粒體是內源性ROS的重要來源,同樣也是ROS損傷的主要靶點,線粒體失能會誘發(fā)細胞內ROS的惡性循環(huán),最終導致氧化應激損傷[9]。而線粒體DNA由于缺乏組蛋白和完善的修復系統(tǒng),容遭受紫外線照射的損傷[10]。因此,過量的UVB照射容易造成MC的氧化應激損傷。臨床中白癜風患者通常以50%～70%的最小紅斑量(MED)作為起始照射劑量(通常為200 mJ/cm2),以后逐漸增加。但是由于患者膚色、聯(lián)合用藥、治療部位等的不同,治療劑量差異較大,照射劑量常根據(jù)經驗調整,有可能導致UVB照射劑量過大,造成MC細胞損傷,促進皮損發(fā)展。因此,尋求一種簡單經濟的治療措施,預防UVB過量造成的MC損傷十分必要。

本實驗顯示,單純熱處理(42℃,60 min,連續(xù)3 d)雖然可以輕度增加細胞的凋亡率,但總體上以促進細胞增殖為主,其效果與低劑量UVB照射(20 mJ/cm2)類似。Nakazawa等[3]認為這種作用可能與p53和p21蛋白表達上調有關。同時,我們還發(fā)現(xiàn),熱聯(lián)合大劑量UVB(100 mJ/cm2)處理細胞,可以降低單純UVB照射導致的細胞凋亡。這與Bivik等[11]的結果一致,他們認為熱應激誘導的HSP70,可以通過抑制組織蛋白酶和細胞色素c的釋放,減少UVB誘導的細胞凋亡。在氧化應激方面,熱處理組與對照組差異無統(tǒng)計學意義,其中熱處理組SOD活力和MDA含量均有輕度下降(均P＞0.05),可能與熱處理后細胞代謝水平升高,總蛋白含量增加有關。與UVB照射組相比,聯(lián)合處理可以明顯降低UVB誘導的ROS和MDA水平,促進SOD活力恢復,對UVB誘導的氧化損傷具有拮抗作用。綜上所述,我們推測熱處理雖然對MC有輕度的損傷作用,但是這種輕度的損傷,可能激活了細胞的防御機制,引發(fā)防御反應,進而對UVB照射引起的氧化應激起到了保護作用。雖然本實驗仍缺乏熱處理拮抗氧化損傷機制的深入研究,但是以上數(shù)據(jù)可以初步提示：適度熱處理(42℃,60 min)對大劑量UVB(100 mJ/cm2)損傷具有保護作用,也提示熱療聯(lián)合UVB不僅可以增強細胞活性和功能,促進皮損恢復,還可減少UVB治療的不良反應,具有良好的應用前景,也為臨床治療色素脫失性疾病提供了新的思路。

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2013-07-19)

(本文編輯：吳曉初)

Effect of heat treatment at 42℃on ultraviolet B-induced oxidative injury to human melanocytes

Hu Wenzhi*，Ma Lijuan，Zhao Guang.*Department of Dermatology，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi′an 710032，China

Zhao Guang，Email:guangfen@yahoo.com

ObjectiveTo evaluate the effect of heat treatment on ultraviolet B(UVB)-induced oxidative injury to human melanocytes.MethodsMelanocytes were isolated from adult foreskins，and subjected to a primary culture.After 3-4 passages of subculture，the melanocytes were classified into 4 groups:control group incubated at 37 ℃，heat treatment group incubated at 42 ℃ for 1 hour，UVB group exposed to UVB irradiation at 100 mJ/cm2，combination group receiving heat treatment at 42℃for 1 hour followed by UVB irradiation at 100 mJ/cm2.After three successive days of treatment，MTT assay was performed to evaluate cell viability，a biochemical method to determine the activity of superoxide dismutase(SOD)and concentration of malonaldehyde(MDA)，and flow cytometry to detect intracellular reactive oxygen species(ROS)and apoptosis in melanocytes.ResultsThe cell survival rate，apoptosis rate，SOD activity，MDA concentration and ROS level were(100 ± 6.14)%，(4.66 ± 0.58)%，(53.39 ± 8.23)U/gprot，(1.09 ± 0.32)mmol/gprot，and 1070.85 ± 42.07 in the control group respectively.UVB exposure induced a significant increase in apoptosis rate(24.14% ±2.90%，P＜0.001)，MDA concentration(1.65±0.33 mmol/gprot，P＜0.01)and ROS level(1416.45±79.12，P＜0.01)，but a significant decrease in cell survival rate(50.23% ±5.36%，P＜0.01)and SOD activity(31.98 ± 11.89 U/gprot，P＜ 0.01)in the UVB group compared with the control group，while the heat pretreatment markedly downregulated the UVB-induced increase in apoptosis rate(14.9% ±1.49%，P＜0.001)，MDA concentration(1.10±0.26 mmol/gprot)and ROS level(1033.30±68.41，P＜0.01)，as well as the decrease in cell survival rate(74.12%±6.17%，P＜0.01)and SOD activity(51.63±6.55 U/gprot，P＜0.01)in the combination group.ConclusionHeat treatment could protect melanocytes from UVB-induced oxidative injury.

Melanocytes;Heat;UVB;Oxidative stress

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.05.010

國家自然科學基金(81271745)

710032西安,第四軍醫(yī)大學西京皮膚醫(yī)院(胡文治);解放軍空軍總醫(yī)院皮膚病醫(yī)院(趙廣、祃麗娟)

趙廣,Email：guangfen@yahoo.com