Peutz-Jeghers綜合征STK11基因突變研究

王昌媛 劉華 宗金寶 劉世國 史同新

Peutz-Jeghers綜合征STK11基因突變研究

王昌媛 劉華 宗金寶 劉世國 史同新

目的探討Peutz-Jeghers綜合征(PJS)STK11基因突變情況,為該病基因診斷及遺傳咨詢提供依據(jù)。方法收集PJS 1個(gè)家系(2例患者)及1例散發(fā)病例,3例患者均有典型的皮膚黏膜黑褐斑和消化道多發(fā)息肉,提取PJS家系中2例患者、6名健康親屬及1例散發(fā)病例、100例健康對(duì)照的外周血基因組DNA,PCR擴(kuò)增STK11基因的9個(gè)外顯子及臨近的內(nèi)含子,對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行DNA直接測序,測序結(jié)果與基因庫中的STK11基因序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果家系中2例患者及1例散發(fā)患者STK11基因的9個(gè)外顯子及臨近內(nèi)含子所有堿基未發(fā)現(xiàn)任何突變,家系中健康親屬及100例健康對(duì)照的STK11基因未發(fā)現(xiàn)突變。結(jié)論P(yáng)JS存在遺傳異質(zhì)性,可能存在新的位點(diǎn)和致病基因。

Peutz-Jeghers綜合征;基因,STK11;突變

Peutz-Jeghers綜合征(PJS)又稱黑斑息肉綜合征(OMIM#175200)是一種少見的常染色體顯性遺傳性疾病,以消化道多發(fā)錯(cuò)構(gòu)瘤性息肉、口唇黏膜黑褐色斑及惡性腫瘤高發(fā)為主要特征。其息肉可發(fā)生在消化道任何部位,以腸道為主,早期比較隱蔽,臨床上常在反復(fù)出現(xiàn)陣發(fā)性腹痛、消化道出血、腸梗阻等嚴(yán)重并發(fā)癥后才得以確診,給患者帶來極大痛苦。黑褐色斑亦可發(fā)生于面部、手足、口腔內(nèi)及外生殖器等部位皮膚黏膜,影響患者美觀。調(diào)查發(fā)現(xiàn)PJS患者消化道及消化道外腫瘤的發(fā)生率顯著增高,約為普通人群的9～18倍,患者一生中各種癌癥累積風(fēng)險(xiǎn)為 93%［1］。1998年 Hemminki和 Jenne等研究證實(shí),位于19p13.3的STK11基因(NG_007460,又稱LKB1基因)是PJS重要的致病基因［2-3］。目前在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(human gene mutation database,HGMD)中已鑒定出的STK11基因致病突變共有200多種,但以往研究表明,部分PJS患者檢測不到該基因的突變［4］。本研究通過DNA測序的方法對(duì)收集的1個(gè)PJS家系及1例散發(fā)的PJS病例進(jìn)行基因突變檢測,以期發(fā)現(xiàn)是否存在STK11基因的致病突變。

對(duì)象與方法

一、臨床資料

圖1 家系圖

圖2 先證者的臨床表現(xiàn) 2a:口腔內(nèi)黏膜黑褐色斑;2b:手指末端散在分布5 mm大小黑褐色斑;2c:胃鏡顯示胃體部息肉

圖3 散發(fā)病例的臨床表現(xiàn) 3a:患者唇部散在分布1～2 mm大小黑褐色斑;3b:腸鏡顯示的腸道息肉

收集的1個(gè)PJS家系(圖1)共3代9人,患者3例。先證者,女,35歲,2歲時(shí)家長發(fā)現(xiàn)口唇出現(xiàn)針尖大小的黑褐色斑點(diǎn),并逐漸累及口腔黏膜和手指末端,黑褐色斑無季節(jié)變化,無明顯自覺癥狀。患者近5年出現(xiàn)間斷性腹痛、便血,1年前行胃鏡、結(jié)腸鏡等檢查顯示胃、十二指腸、結(jié)腸多發(fā)性息肉,組織病理示增生性息肉,經(jīng)內(nèi)鏡切除部分息肉后,腹痛、便血等癥狀減輕。皮膚科檢查見唇部、口腔內(nèi)黏膜及手指末端散在1 mm至5 mm大小黑褐色斑,手指末端的黑褐色斑數(shù)量少,但單個(gè)面積較大(圖2)。先證者的父母非近親結(jié)婚,父親已去世(死因不詳),先證者回憶其父口唇部有黑褐色斑點(diǎn),先證者育有1女1子,女兒7歲,2歲時(shí)口唇出現(xiàn)類似黑褐色斑,目前未出現(xiàn)胃腸道癥狀,兒子3歲,皮膚黏膜未發(fā)現(xiàn)黑斑。收集的1例散發(fā)病例,女,28歲,1歲時(shí)發(fā)現(xiàn)口唇出現(xiàn)黑褐色斑,后累及雙手手指(圖3)。1年前出現(xiàn)腹痛、便血,3個(gè)月前在消化內(nèi)科住院,行胃鏡、腸鏡及組織病理檢查示消化道多發(fā)性腺瘤樣息肉并部分切除。健康對(duì)照組來自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院山東省代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的100例健康人外周血。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者簽署知情同意書。

二、方法

1.外周血DNA的提取:抽取家系中2例患者、6例健康親屬及1例散發(fā)病例的靜脈抗凝血各5 ml,用Tiangen產(chǎn)DNA提取試劑盒(離心柱型)提取患者與健康對(duì)照的基因組DNA。利用Nanodrop2000微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific)對(duì)提取的DNA進(jìn)行純度和濃度檢測。

2.PCR擴(kuò)增:用Primer Premer5軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增STK11基因第1～9外顯子,由北京Invitrogen公司合成引物。PCR反應(yīng)體系為25 μl,包括2×Power Taq PCR Master Mix 12.5 μl、上下游引物(10 μmol/L)各1 μl、DNA 模板(50 ng/μl)2 μl、滅菌雙蒸水 8.5 μl。PCR參數(shù):94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,60℃～68℃退火30 s(表1),72℃延伸45 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min,再逐漸降至4℃。

3.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,利用UVP凝膠成像儀進(jìn)行圖像掃描,于相應(yīng)位置處見單一條帶。PCR產(chǎn)物送至上海申速生物有限公司進(jìn)行直接測序。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增片段長度及退火溫度

結(jié) 果

一、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

STK11基因全部外顯子經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,在相應(yīng)分子量位置擴(kuò)增條帶其產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相符(圖4),清晰單一,特異性良好,進(jìn)行DNA測序。

二、STK11基因全部外顯子DNA測序結(jié)果

測序結(jié)果與STK11基因的正常序列進(jìn)行比對(duì)分析(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/),家系中 2 例患者及1例散發(fā)患者STK11基因的9個(gè)外顯子及鄰近內(nèi)含子的DNA序列均未發(fā)現(xiàn)任何堿基的突變。家系中6例健康親屬及100例健康對(duì)照者STK11基因的9個(gè)所有外顯子及鄰近內(nèi)含子的DNA序列未發(fā)現(xiàn)任何堿基的突變。

討 論

研究選取的所有患者均經(jīng)過皮膚科和消化內(nèi)科醫(yī)師的確診,符合2010年消化系統(tǒng)腫瘤WHO分類中推薦的PJS診斷標(biāo)準(zhǔn):①組織學(xué)上證實(shí)PJ息肉≥3個(gè);②有PJS家族史,且出現(xiàn)PJ息肉(不管數(shù)量多少);③存在典型而顯著的皮膚黏膜色素沉著,并有PJS家族史;④任何數(shù)量的PJ息肉并且有顯著的皮膚黏膜色素沉著(符合以上任何一條標(biāo)準(zhǔn)即可診斷)。國外研究資料統(tǒng)計(jì),有家族史的PJS患者STK11基因突變的檢出率為70%～80%,散發(fā)病例檢出率為25%［5］,認(rèn)為PJS存在遺傳異質(zhì)性,可能存在新的位點(diǎn)和致病基因。文獻(xiàn)顯示中國人PJS患者的STK11基因突變率更低,約占33.3%［6］。本研究中PJS家系中2例患者及1例散發(fā)病例均未檢測出STK11基因的所有外顯子及鄰近內(nèi)含子的突變,也進(jìn)一步證實(shí)了這一現(xiàn)象。STK11基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是一種抑癌基因,包含3個(gè)主要區(qū)域,N端催化區(qū)域激酶、激酶催化區(qū)域和C端調(diào)節(jié)區(qū)域。

圖4 PCR結(jié)果 M:標(biāo)準(zhǔn)參照物;1～9:STK11基因9個(gè)外顯子

分析一部分PJS患者檢測不到的原因可能為:①PJS存在遺傳異質(zhì)性,有待研究發(fā)現(xiàn)新的位點(diǎn),克隆新的致病基因。2004年Jiang等［7］對(duì)10個(gè)無STK11基因突變的PJS家系進(jìn)行了STK13的基因研究,但未檢測到致病的基因突變。下一步我們可以收集無STK11基因突變的較大的PJS家系進(jìn)行連鎖分析,尋找新的致病位點(diǎn);②STK11基因的致病突變位點(diǎn)不在外顯子區(qū)域,而在包含啟動(dòng)子的非編碼序列。易鑫等［8］對(duì)15個(gè)來自不同家系的PJS患者進(jìn)行了STK11基因啟動(dòng)子-1160至-1543區(qū)間的突變分析,發(fā)現(xiàn)一SNP位點(diǎn)(-1275)G→T,認(rèn)為是PJS的易感因素,但沒有大樣本數(shù)據(jù)的驗(yàn)證;③STK11基因表達(dá)調(diào)控的過程中出現(xiàn)異常,2010年康曉靜等在一PJS家系中發(fā)現(xiàn)息肉組織STK11基因外顯子8的一個(gè)新的雜合突變,而在患者外周血中未發(fā)現(xiàn)此突變［4］;④PJS患者的STK11基因存在大片段的缺失,應(yīng)用常規(guī)的基因測序方法無法檢測出。Volikos等用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(Multiplex Ligation dependent Probe Amplification，MLPA) 檢測常規(guī)測序方法未發(fā)現(xiàn)STK11基因突變的PJS患者,發(fā)現(xiàn)STK11基因種系突變率大約為80%,遠(yuǎn)高于常規(guī)測序方法的檢出率［9］。

盡管已經(jīng)對(duì)PJS的基因進(jìn)行了深入研究,但因?yàn)槠渲虏』虻膹?fù)雜性,還需要收集更多的樣本對(duì)上述原因展開進(jìn)一步的研究。

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2013-03-05)

(本文編輯:吳曉初)

Mutation analysis of STK11 gene in patients with Peutz-Jeghers syndrome

Wang Changyuan*，Liu Hua，Zong Jinbao，Liu Shiguo，Shi Tongxin.*Department of Dermatology，Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266011，China

Shi Tongxin，Email：shitx2006@163.com

ObjectiveTo study the mutation of STK11 gene in a Chinese family and a sporadic patient with Peutz-Jeghers syndrome(PJS)，and to provide a basis for genetic diagnosis and counseling.MethodsOne sporadic patient and two patients from a family with PJS were collected，all of whom had typical mucosal pigmentation and gastrointestinal polyposis.Blood samples were obtained from the two patients and six unaffected relatives in this family，the sporadic patient，and 100 healthy controls.DNA was extracted，and PCR was performed to amplify nine exons and their adjacent introns in the STK11 gene followed by direct sequencing.The sequencing results were aligned to the published sequence of STK11 gene from Genbank.ResultsNo mutation was found in the STK11 gene of any of the patients，unaffected relatives，or healthy controls.ConclusionsGenetic heterogeneity exists in Peutz-Jeghers syndrome，hinting that there may be other causative genes or sites for this entity.

Peutz-Jeghers syndrome；Gene，STK11；Mutation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.012

青島市衛(wèi)生科技計(jì)劃(2010-ws20011)

266011青島市市立醫(yī)院皮膚科(王昌媛、史同新);青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(劉華);青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科(宗金寶),山東省代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(劉世國)

史同新,Email:shitx2006@163.com