pORF5質(zhì)粒蛋白拮抗LL37抗菌肽增強(qiáng)沙眼衣原體感染的初步研究

馬康康 李忠玉 粟盛梅 曹文娟 戴文婷 楊曉玉 賀紅梅 鐘光明

pORF5質(zhì)粒蛋白拮抗LL37抗菌肽增強(qiáng)沙眼衣原體感染的初步研究

馬康康 李忠玉 粟盛梅 曹文娟 戴文婷 楊曉玉 賀紅梅 鐘光明

目的探討pORF5質(zhì)粒蛋白能否通過(guò)抑制LL37抗菌肽增強(qiáng)沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis, Ct)感染,并初步探討其分子機(jī)制。方法表達(dá)并純化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白經(jīng)蛋白酶酶切制備不含GST標(biāo)簽的pORF5蛋白;pORF5蛋白和LL37單獨(dú)或共孵育衣原體后再感染HeLa細(xì)胞,間接免疫熒光技術(shù)計(jì)數(shù)衣原體包涵體形成數(shù)量;熒光定量PCR檢測(cè)TNF-α、LL37基因表達(dá)水平。結(jié)果單獨(dú)Ct感染組衣原體包涵體形成單位(IFU)為3.8×105/ml,LL37處理組IFU為2.0×105/ml,pORF5蛋白處理組IFU為3.0×105/ml, pORF5蛋白和LL37共處理組IFU為3.1×105/ml。pORF5蛋白處理組、LL37與pORF5蛋白共處理組和單獨(dú)Ct感染組之間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但明顯高于LL37單獨(dú)處理組(P＜0.05)。pORF5蛋白和LL37共同處理組TNF-α表達(dá)水平明顯高于LL37單獨(dú)處理組(P＜0.01);pORF5蛋白處理組較Ct處理組LL37基因轉(zhuǎn)錄水平下降了19%。結(jié)論pORF5質(zhì)粒蛋白能拮抗LL37抗菌肽增強(qiáng)Ct感染,其機(jī)制可能與上調(diào)腫瘤壞死因子α、下調(diào)LL37表達(dá)相關(guān)。

沙眼衣原體;pORF5質(zhì)粒蛋白;LL37;抗菌肽類

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)是一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌,共有19個(gè)血清型, A～C血清型可感染引起沙眼,L血清型可感染引起性病淋巴肉芽腫,D～K血清型可感染人體泌尿生殖系統(tǒng),引起非淋菌性尿道炎、宮頸炎、不孕癥等,對(duì)人類生殖健康造成極大危害[1]。Ct感染患者HIV陽(yáng)性率[2]和宮頸癌[3]發(fā)生率也明顯高于正常人群。由于Ct感染后癥狀不明顯,極易被患者忽視而得不到及時(shí)有效的治療導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥。因此,闡明Ct的致病機(jī)制、研制有效疫苗對(duì)預(yù)防控制衣原體感染性疾病有重要意義[4]。Ct除含有約1 mb的基因外,各血清型中亦存在一個(gè)7.5 kb的隱蔽性質(zhì)粒,有研究報(bào)道,衣原體質(zhì)粒缺失菌株不能激活TLR2依賴的免疫反應(yīng),不引起上生殖道病變[5-6],提示質(zhì)粒能編碼毒力因子參與衣原體上行性感染和病理?yè)p傷過(guò)程。在質(zhì)粒編碼的8種質(zhì)粒蛋白中, pORF5是唯一定位于包涵體外的分泌性蛋白[7]。LL37抗菌肽是目前發(fā)現(xiàn)的人類唯一的Cathelicidins家族成員,廣泛分布于各種上皮細(xì)胞中,具有廣譜的抗菌活性,能降低衣原體的感染率。本研究旨在探討pORF5質(zhì)粒蛋白能否通過(guò)拮抗LL17抗菌肽促進(jìn)Ct感染,并初步分析其分子機(jī)制,為深入研究pORF5蛋白功能,闡明Ct致病機(jī)制提供依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.菌株與質(zhì)粒:pGEX-6p/pORF5重組質(zhì)粒、E.coliXL1-blue菌株、HeLa細(xì)胞均由本研究所保存。

2.主要試劑:預(yù)染蛋白 Marker為美國(guó)Fermentas公司產(chǎn)品,Glutathione Sepharose 4B購(gòu)于美國(guó)Pharmacia公司,PreScission Protease、Cy2標(biāo)記的羊抗兔IgG為美國(guó)GE Healthcare公司產(chǎn)品,血清及DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品, HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品,LL37由上海濤宇國(guó)際貿(mào)易有限公司合成。

二、方法

1.衣原體的感染:將HeLa細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,18～24 h培養(yǎng)后長(zhǎng)至單層,棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,細(xì)胞經(jīng)30 μg/ml DEAE-dextran處理10 min后加入衣原體感染液,37℃孵育2 h后棄去上清,加入含有2 μg/ml放線菌酮的完全培養(yǎng)基,37℃, 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)40 h。

2.pORF5融合蛋白GST標(biāo)簽的切割與鑒定:將 pGEX-6p/pORF5原核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化XL1-Blue大腸桿菌,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h,離心收集誘導(dǎo)后細(xì)菌,超聲破菌后12 000×g離心收集上清。利用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B純化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白加入蛋白酶,室溫4 h或4℃過(guò)夜后離心,收集上清和磁珠洗脫液即為去除GST標(biāo)簽的pORF5蛋白。切割后的pORF5蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳,以pORF5多抗為一抗,羊抗鼠IgG為二抗,進(jìn)行Western印跡分析鑒定。同時(shí)將純化后的pORF5蛋白與50 mg/ml的多粘菌素B 37℃孵育30 min以去除內(nèi)毒素,BCA法測(cè)定pORF5蛋白濃度。

3.間接免疫熒光實(shí)驗(yàn):Ct感染HeLa細(xì)胞40 h后,4%甲醛室溫固定30 min,2%皂素透膜處理1 h, PBS洗滌細(xì)胞后加入1%BSA室溫封閉1 h,然后再依次加入兔抗衣原體抗體,37℃孵育1 h;Cy2標(biāo)記的羊抗兔抗體、Hoechst 33258,37℃1 h,最后PBS洗滌、封片,干燥,熒光顯微鏡觀察結(jié)果并拍照保存。

4.pORF5和LL37對(duì)衣原體感染的影響:HeLa細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,106個(gè)/孔,37℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。DEAE-dextran處理后將實(shí)驗(yàn)分為4組:第1組為20 μg/ml LL37和30 μg/ml pORF5蛋白37℃孵育30 min后,與衣原體繼續(xù)孵育2 h后感染HeLa細(xì)胞;第2組為20 μg/ml LL37與衣原體孵育2 h后感染HeLa細(xì)胞;第3組為30 μg/ml pORF5與衣原體孵育2 h后感染HeLa細(xì)胞;第4組為單獨(dú)Ct感染組。各處理組置于37℃,5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,棄上清,加入含有2 μg/ml放線菌酮的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)40 h。細(xì)胞固定后進(jìn)行間接免疫熒光染色,熒光顯微鏡計(jì)數(shù)各組包涵體形成數(shù)量。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR:從基因庫(kù)中查詢LL37、腫瘤壞死因子(TNF)α基因DNA序列,設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄采用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系:cDNA 1 μl,qPCR混合物10 μl,正、反向引物各0.4 μl,滅菌蒸餾水補(bǔ)充至總體積20 μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性10 min,94℃變性15 s, 60℃退火15 s,72℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)后,72℃繼續(xù)延伸5 min。基因的表達(dá)量的計(jì)算采用△△Ct方法,即基因相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct,△△Ct=(Ct實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因)-(Ct對(duì)照組目的基因-Ct對(duì)照組內(nèi)參基因)

表1 熒光定量PCR引物序列

6.pORF5和LL37對(duì)衣原體感染HeLa細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響:按上述方法將實(shí)驗(yàn)分為4組, LL37與pORF5蛋白單獨(dú)或共同孵育后處理衣原體,感染單層HeLa細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)6 h后收集細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增TNF-α基因,采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。ELISA測(cè)定各處理24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α濃度,分析目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平的差異。

7.pORF5對(duì)衣原體感染HeLa細(xì)胞LL37表達(dá)的影響:HeLa細(xì)胞培養(yǎng)至單層后分成3組,加入經(jīng)30 μg/ml pORF5蛋白室溫預(yù)孵2 h的衣原體感染液;直接加入衣原體感染液;空白對(duì)照組。細(xì)胞經(jīng)上述處理2 h后更換為含有放線菌酮的完全培養(yǎng)基, 6 h后消化收集細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LL37表達(dá)的變化,ELISA測(cè)定各處理24 h后的培養(yǎng)上清中LL37濃度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、pORF5融合蛋白的純化與GST標(biāo)簽的切割

重組質(zhì)粒pGEX-6p/pORF5轉(zhuǎn)化到XL1-Blue大腸桿菌,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性pORF5融合蛋白,融合蛋白經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B純化后,蛋白酶切割GST標(biāo)簽,收集上清和磁珠洗脫液即為酶切后pORF5蛋白。pORF5蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析,可見大小約28 000有清晰條帶,與pORF5蛋白大小一致(圖1a)。以酶切后pORF5蛋白為抗原,鼠抗pORF5多抗作為一抗,羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western印跡分析,結(jié)果在28 000處出現(xiàn)清晰條帶(圖1b)。

圖1 pORF5蛋白的純化與鑒定 1a:酶切后pORF5蛋白的SDS-PAGE鑒定 1:標(biāo)準(zhǔn)參照物;2:未經(jīng)酶切的GST-pORF5融合蛋白;3:酶切后上清;4:第1次洗脫液;5:第2次洗脫液;6:第3次洗脫液;7:酶切后GST-pORF5融合蛋白beads。1b:酶切后pORF5蛋白的Western印跡鑒定 1:XL1 Blue E.coli裂解產(chǎn)物;2:酶切后無(wú)GST標(biāo)簽的pORF5蛋白

二、pORF5蛋白拮抗LL37抗菌肽促進(jìn)衣原體感染

用30 μg/ml pORF5蛋白和20 μg/ml LL37單獨(dú)或共同與Ct孵育后感染HeLa細(xì)胞,間接免疫熒光法計(jì)數(shù)結(jié)果顯示單獨(dú)Ct感染組包涵體形成單位(IFU)為3.8×105/ml,LL37處理組IFU為2.0×105/ml, pORF5蛋白處理組IFU為3.0×105/ml,pORF5蛋白與LL37共同處理組IFU為3.1×105/ml(圖2)。LL37處理組衣原體IFU明顯減少,與單獨(dú)Ct感染組相比較,IFU下降了47%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。pORF5蛋白與LL37共同處理組IFU較LL37單獨(dú)組IFU增加了55%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但與pORF5蛋白單獨(dú)處理組比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見圖3。

圖2 間接免疫熒光法檢測(cè)衣原體包涵體 HeLa細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板后培養(yǎng)18～24 h長(zhǎng)至單層,分別用30 μg/ml pORF5蛋白和20 μg/ml LL37單獨(dú)或共同與Ct孵育后感染HeLa細(xì)胞,40 h后細(xì)胞固定進(jìn)行間接免疫熒光染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)各處理組包涵體形成單位值,結(jié)果發(fā)現(xiàn)pORF5蛋白處理組、pORF5蛋白與LL37共處理組和空白對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但高于LL37單獨(dú)處理組(P＜0.05)。綠色為衣原體;藍(lán)色為DNA

三、pORF5蛋白拮抗LL37增強(qiáng)TNF-α表達(dá)

分別提取不同處理組HeLa細(xì)胞總RNA,將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照,對(duì)TNF-α基因的表達(dá)情況進(jìn)行相對(duì)定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LL37處理組HeLa細(xì)胞TNF-α基因的表達(dá)水平顯著低于單獨(dú)Ct感染組與pORF5蛋白處理組(P＜0.01),分別約減少了5.8倍和6.3倍,pORF5蛋白與LL37共處理組較LL37單獨(dú)處理組TNF-α基因的表達(dá)水平增加了3.5倍。ELISA結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)LL37處理組TNF-α表達(dá)水平明顯低于pORF5單獨(dú)或與LL37共處理組(P＜0.01)。見表2。

表2 腫瘤壞死因子α mRNA和蛋白表達(dá)(±s)

表2 腫瘤壞死因子α mRNA和蛋白表達(dá)(±s)

注:n=3。a:與LL37處理組、pORF5蛋白與LL37共處理組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),與pORF5蛋白處理組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);b:與LL37處理組、pORF5蛋白與LL37共處理組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);c:與pORF5蛋白與LL37共處理組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

組別 mRNA表達(dá) 蛋白表達(dá)(pg/ml)單獨(dú)Ct感染組 1.51±0.14a 2 120.9±248.1a Ct+pORF5處理組 1.62±0.21b 1 999.8±208.9b Ct+LL37處理組 0.22±0.02c 678.4±75.2c Ct+pORF5+LL37處理組 1.00±0.09 1 388.6±156.1

四、pORF5蛋白下調(diào)Ct感染HeLa細(xì)胞LL37的表達(dá)

圖3 不同處理組包涵體形成單位計(jì)數(shù)結(jié)果 a:與單獨(dú)Ct感染組、pORF5蛋白單獨(dú)處理組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),與LL37處理組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);b:與單獨(dú)Ct感染組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),與LL37處理組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);c:與單獨(dú)Ct感染組、pORF5蛋白單獨(dú)處理組、pORF5蛋白與LL37共處理組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

以不同稀釋度的對(duì)照樣本建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線中Ct值和樣本LL37濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.99,基因擴(kuò)增效率在85%以上。將實(shí)驗(yàn)組各樣本10倍稀釋后,分別用LL37和β肌動(dòng)蛋白特異性引物擴(kuò)增,計(jì)算出各樣品LL37基因相對(duì)定量;同時(shí)收集24 h培養(yǎng)后上清, ELISA測(cè)定LL37表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ct處理組與pORF5蛋白處理組LL37基因的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平較對(duì)空白照組均明顯增加(P＜0.01),pORF5蛋白處理組較Ct處理組LL37基因轉(zhuǎn)錄水平下降了19%。見表3。

表3 LL37基因mRNA和蛋白表達(dá)(±s)

表3 LL37基因mRNA和蛋白表達(dá)(±s)

注:n=3。a:與空白對(duì)照組、pORF5蛋白處理組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);b:與空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

組別 mRNA表達(dá) 蛋白表達(dá)(pg/ml)空白對(duì)照組 0.06±0.01 4.5±1.5單獨(dú)Ct感染組 1.12±0.15a 135.5±21.2a Ct+pORF5處理組 0.93±0.10b 95.3±15.8b

討論

Ct進(jìn)入生殖道后,首先是具有感染性的原體(EB)吸附于黏膜上皮細(xì)胞,在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體,進(jìn)而轉(zhuǎn)化為代謝活躍的網(wǎng)狀體(RB),RB以二分裂形式繁殖,形成眾多的子代RB,子代RB重新轉(zhuǎn)化為EB并釋放出細(xì)胞外再感染鄰近細(xì)胞。為實(shí)現(xiàn)Ct在生殖道組織的上行性感染,EB必須存在某種機(jī)制拮抗生殖道黏膜局部固有免疫。作為生殖道黏膜固有免疫的重要組成部分,抗菌肽具有廣譜抗微生物特性[8-9]。人類抗菌肽主要有防御素家族和Cathelicidin家族,LL37是Cathelicidin家族中唯一存在于人體的成員,廣泛分布于各種上皮細(xì)胞中,是人體天然防御的重要組成部分,對(duì)G+和G-細(xì)菌均有很好的殺傷作用[10],能夠降低衣原體的感染率[11]。Ct是如何抵抗生殖道LL37抗菌肽的抗菌作用至今仍不清楚。

Ct19個(gè)血清型中均存在7.5 kb的隱蔽性質(zhì)粒,質(zhì)粒不是衣原體生存的必須元件,但衣原體質(zhì)粒缺失株毒力高度降低,不能上行引起生殖道病變[5-6],充分提示質(zhì)粒能編碼某種毒力因子并能拮抗抗菌肽的抗菌活性,促進(jìn)Ct感染上行擴(kuò)散。我們[12-13]前期研究已經(jīng)證實(shí)pORF5蛋白體內(nèi)外均能促進(jìn)IL-1β、IL-8、TNF-α等多種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,提示pORF5蛋白可能參與了衣原體免疫病理?yè)p傷過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)首先用抗菌肽LL37處理Ct后再感染HeLa細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Ct IFU明顯降低,較單獨(dú)Ct感染組降低了47%,證實(shí)LL37能夠抑制Ct的感染。進(jìn)一步將pORF5蛋白和LL37共同處理Ct后感染HeLa細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Ct IFU明顯增多,較LL37單獨(dú)處理組IFUs上升了55%,充分說(shuō)明pORF5蛋白能拮抗LL37抗衣原體活性促進(jìn)Ct感染。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn)Ct處理組、pORF5蛋白處理組的HeLa細(xì)胞TNF-α基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高,但LL37處理組TNF-α基因轉(zhuǎn)錄水平明顯降低,分別較Ct處理組與pORF5蛋白處理組約降低了5.8倍和6.3倍,當(dāng)用pORF5蛋白預(yù)先與LL37孵育后再處理Ct,發(fā)現(xiàn)TNF-α基因轉(zhuǎn)錄水平恢復(fù)上升水平,較LL37單獨(dú)處理組TNF-α基因表達(dá)水平增加了3.5倍。進(jìn)一步測(cè)定TNF-α蛋白表達(dá)水平,結(jié)果亦顯示,pORF5與LL37共處理組TNF-α表達(dá)水平明顯高于LL37處理組,提示pORF5質(zhì)粒蛋白能拮抗LL37增強(qiáng)TNF-α表達(dá)。作為一種重要的前炎癥細(xì)胞因子,TNF-α能夠激活炎癥反應(yīng)并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡,持續(xù)產(chǎn)生的TNF-α能夠引發(fā)組織損傷[14],使宮頸部位出現(xiàn)充血、水腫等癥狀并伴有分泌增加等,有利于Ct感染的上行擴(kuò)散,在衣原體持續(xù)性感染過(guò)程中具有重要作用。本研究結(jié)果顯示,pORF5蛋白能拮抗LL37作用提高Ct感染HeLa細(xì)胞TNF-α的表達(dá),TNF-α水平的升高一方面可誘導(dǎo)Ct感染細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡,促進(jìn)Ct在細(xì)胞的擴(kuò)散;另一方面放大炎癥反應(yīng),促進(jìn)Ct持續(xù)性感染。

為初步探討pORF5蛋白在Ct感染過(guò)程中的作用,本研究分別用Ct或pORF5蛋白預(yù)先與Ct孵育后再感染HeLa細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ct能較高水平地誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞中LL37基因轉(zhuǎn)錄,pORF5蛋白處理組HeLa細(xì)胞LL37基因轉(zhuǎn)錄水平高于對(duì)照組,但較Ct處理組LL37轉(zhuǎn)錄水平下降19%;同時(shí)pORF5蛋白處理組LL37蛋白表達(dá)水平明顯降低Ct處理組。Bergman等[15]研究發(fā)現(xiàn),淋球菌可通過(guò)降低LL37的表達(dá)抑制其抗淋球菌活性,從而為淋球菌提供有利的生殖道生存環(huán)境,提示pORF5蛋白亦可通過(guò)下調(diào)Ct感染細(xì)胞LL37表達(dá)水平,降低LL37對(duì)Ct感染的抑制作用,最終促進(jìn)Ct在生殖道組織的生存與擴(kuò)散。本研究初步證實(shí)pORF5蛋白可能通過(guò)上調(diào)TNF-α、下調(diào)LL37基因表達(dá),降低LL37對(duì)Ct感染的抑制作用,為進(jìn)一步闡明Ct持續(xù)性感染中免疫致病機(jī)制提供依據(jù)。然而pORF5蛋白拮抗LL37抗菌肽是直接通過(guò)與LL37結(jié)合封閉其活性區(qū)域,或者改變LL37表面電荷分布以達(dá)到抑制LL37的抗Ct作用等尚待進(jìn)一步研究。

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2014-01-07)

(本文編輯:吳曉初)

pORF5 plasmid protein promotesChlamydia trachomatisinfection through inhibition of the antibacterial peptide LL37:a preliminary study

Ma Kangkang，Li Zhongyu*，Su Shengmei，Cao Wenjuan，Dai Wenting，Yang Xiaoyu，He Hongmei，Zhong Guangming.*Institute of Pathogenic Biology，Medical College，University of South China，Hengyang 421001，Hunan，China

Li Zhongyu，Email:nhlzhy1023@126.com

ObjectiveTo investigate whether pORF5 plasmid protein promotesChlamydia trachomatis(Ct) infection through inhibition of the antibacterial peptide LL37，and to explore its potential molecular mechanism.MethodsAfter expression and purification，the glutathione S-transferase(GST)-pORF5 fusion protein was digested with proteases to obtain pORF5 protein without GST tag.Some Hela cells were classified into four groups:Ct group infected with unpretreated Ct，pORF5 group infected with Ct that had been pretreated with pORF5 of 30 μg/ml for 2 hours，LL37 group infected with Ct that had been pretreated with LL37 of 20 μg/ml for 2 hours，combination group infected with Ct that had been pretreated with pORF5 of 30 μg/ml and LL37 of 20 μg/ml for 2 hours.After additional culture，indirect immunofluorescence assay was performed to count the number of Ct inclusion-forming units(IFUs)，and real-time，fluorescence-based quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) to detect the protein and mRNA expressions of tumor necrosis factor-α(TNF-α)respectively.Some Hela cells were divided into three groups:blank control group remaining untreated，Ct group infected with unpretreated Ct，pORF5 group infected with Ct that had been pretreated with pORF5 of 30 μg/ml for 2 hours.After 6 hours of additional culture，real-time，fluorescence-based quantitative PCR and ELISA were conducted to measure the mRNA and protein expressions of LL37，respectively.ResultsThe concentration of IFUs was significantly higher in the Ct group，pORF5 group and combination group than in the LL37 group(3.8×105/ml，3.0×105/ml and 3.1×105/ml vs.2.0×105/ml，allP＜0.05)，with no significant differences between the Ct group，pORF5 group and combination group(P＞0.05).The expressions of TNF-α mRNA and protein were significantly increased in the combination group compared with the LL37 group.The mRNA expression of LL37 was reduced by 19%in the pORF5 group compared with the Ct group.ConclusionspORF5 plasmid protein could promote Ct infection by counteracting the antibacterial peptide LL37，which may be associated with the up-regulation of TNF-α expression and downregulation of LL37 expression in Ct-infected cells.

Chlamydia trachomatis;pORF5 plasmid protein;LL37;Antimicrobial peptides

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.005

國(guó)家自然科學(xué)基金(81102230、31470277);湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金(13K081);湖南省普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(湘教通[2012]312號(hào));湖南省高層次衛(wèi)生人才“225”工程培養(yǎng)項(xiàng)目(2013-13)

421001湖南衡陽(yáng),南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所[馬康康(現(xiàn)在吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室, 416000湖南吉首)、李忠玉、粟盛梅、曹文娟、戴文婷、楊曉玉、賀紅梅];美國(guó)德州大學(xué)圣安東尼奧健康科學(xué)中心(鐘光明)

李忠玉,Email:nhlzhy1023@126.com