凝集生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞分泌性蛋白組的初步分析

夏汝山 顧靜 陶詩沁 楊莉佳

凝集生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞分泌性蛋白組的初步分析

夏汝山 顧靜 陶詩沁 楊莉佳

目的了解毛乳頭細(xì)胞在凝集生長(zhǎng)狀態(tài)下分泌性蛋白組的表達(dá)。方法以凝集和非凝集生長(zhǎng)的毛乳頭細(xì)胞為研究對(duì)象,分別制備分泌性蛋白質(zhì),以雙向凝膠電泳技術(shù)和PDQuest軟件分析二者之間的蛋白圖譜的差異,通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MLDI-TOF-MS)鑒定表達(dá)差異的蛋白質(zhì),通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫NCBInr檢索分析。結(jié)果建立了重復(fù)性好、分辨率高的雙向電泳圖譜;在凝集生長(zhǎng)和非凝集生長(zhǎng)的毛乳頭細(xì)胞分泌性蛋白質(zhì)中分別檢測(cè)到(1 134±52)個(gè)和(1 078±36)個(gè)蛋白點(diǎn),大多匹配。按照差異量在5倍以上的標(biāo)準(zhǔn),二者存在差異蛋白質(zhì)28個(gè),經(jīng)過MLDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定出10種差異表達(dá)蛋白點(diǎn),其中8種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),分別為Rho GDP分離抑制劑1、細(xì)絲蛋白A、胱抑素C、纖維連接蛋白、親環(huán)素A、前膠原C端蛋白酶增強(qiáng)子、組織金屬蛋白酶抑制劑、組織金屬蛋白酶-2抑制劑。2種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào),為神經(jīng)肽h3和基質(zhì)金屬蛋白酶-3金屬蛋白酶組織抑制劑-1復(fù)合物復(fù)合物。結(jié)論凝集生長(zhǎng)和非凝集生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞差異蛋白主要涉及信號(hào)通路、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞外基質(zhì)合成及降解等功能。

毛乳頭細(xì)胞;分泌蛋白質(zhì)類;電泳,凝膠,雙向;MALDI-TOF質(zhì)譜

毛乳頭是毛囊的真皮部分,體外培養(yǎng)時(shí)呈凝集性生長(zhǎng)為其特性之一,有誘導(dǎo)毛囊形成和再生的能力。隨著細(xì)胞傳代至第6～15代時(shí),毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells，DPC)失去凝集性生長(zhǎng)特性并失去誘導(dǎo)毛囊形成和毛囊再生的能力。研究證實(shí),凝集生長(zhǎng)的DPC分泌大量蛋白樣因子,共同調(diào)節(jié)其他DPC、外根鞘細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[1]。研究這些蛋白質(zhì),對(duì)于闡明毛囊周期調(diào)控,解決脫發(fā)問題具有一定的價(jià)值。然而,這些有重要功能的蛋白質(zhì)大多是低豐度蛋白質(zhì),由于含量少,樣品制備成為實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。在前期[2]工作中,我們建立了制備DPC分泌性蛋白質(zhì)組方法。在本研究中,我們通過蛋白質(zhì)組學(xué)比較凝集與非凝集生長(zhǎng)DPC的蛋白表達(dá)差異,探討DPC凝集生長(zhǎng)的生理基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

1.試劑及儀器:DMEM培養(yǎng)基為美國Hyclone公司產(chǎn)品;IPG膠條(pH3～10,13 cm)、IPG緩沖液、DTT、碘乙酰胺、CHAPS、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris為美國Amersham Pharmacia產(chǎn)品;三氟乙酸、胰蛋白酶為美國Sigma產(chǎn)品。硝酸銀為國產(chǎn)試劑。雙向電泳模具、IPGPhorⅡ型等電聚焦儀和SE600電泳儀為美國Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品;凝膠掃描儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;MALDITOF質(zhì)譜儀為德國Burker公司產(chǎn)品。

2.標(biāo)本:所需毛乳頭來自門診外科頭皮術(shù)后殘留的含毛發(fā)正常組織。經(jīng)無錫市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng):采用“二步酶”法分離和培養(yǎng)人頭皮毛乳頭,DPC在常規(guī)條件下擴(kuò)大培養(yǎng),培養(yǎng)第3代以前為凝集性生長(zhǎng)DPC,第6代以后為非凝集性生長(zhǎng)DPC(圖1)。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),用0.1 mol/L PBS洗滌3次,加入適量Williams E無血清培養(yǎng)基,孵育24 h后收集無血清培養(yǎng)上清,在4℃低溫、1 699×g條件下離心1 h,收集上清液。

2.蛋白質(zhì)樣品制備:DPC分泌性蛋白質(zhì)制備,參照已建立的方法[2]。

3.雙向電泳及圖像分析:雙向電泳參照G?rg等[3]描述的方法,150 μg總蛋白與重水化液(8 mol/L尿素,2%CHAPS,60 mmol/L DTT和0.5%IPG緩沖液pH 3～10)混合,總體積250 μl吸入IPG膠槽,置于IPGphor等電聚焦儀電極板上,重水化和等電聚焦在20℃自動(dòng)進(jìn)行,總電壓時(shí)間積40 000 Vh。等電聚焦后于平衡液中平衡2次。SDS-PAGE在SE600電泳儀中進(jìn)行。電泳結(jié)束后,用質(zhì)譜兼容的銀染法染色,超純水脫色至背景清楚。用Gel Doc 2000成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行掃描,圖像經(jīng)PDQuest分析軟件進(jìn)行處理并比較差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。

4.肽質(zhì)量指紋譜(PMF)鑒定:選取差異5倍以上的蛋白點(diǎn),從凝膠上準(zhǔn)確切割后用水清洗幾次后用含50%乙腈,25 mmol/L NH4HCO3溶液浸泡膠片,至膠片中藍(lán)色褪盡;真空離心干燥使膠片完全脫水,加入0.01 μg/μl的胰酶溶液5～10 μl,待酶液完全吸收后補(bǔ)充10 μl 25 mmol/L NH4HCO3,37℃保溫15 h;加5%三氟乙酸50～100 μl于40℃保溫1 h,吸出上清,加入2.5%三氟乙酸,50%乙腈50～100 μl于30℃保溫1 h,吸出上清,合并上清液,冷凍干燥。制備好的樣品置于質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析,采用線性模式、正離子譜測(cè)定,離子源加速電壓1為20 kV,加速電壓2為18.85 kV,N2激光波長(zhǎng)337 nm,脈沖寬度為3 ns,離子延遲提取500 ns,真空度4× 10-7Torr,質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加50次,并用基質(zhì)峰和胰蛋白酶自動(dòng)降解離子峰為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜峰,獲得PMF。

5.數(shù)據(jù)庫查詢:通過中國國家生物醫(yī)學(xué)中心的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)站(www.proteomics.com.cn),Mascot網(wǎng)站(http://www.matrixscience.com/)查詢。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:雙向電泳實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,電泳圖譜經(jīng)PDQuest軟件分析,蛋白點(diǎn)數(shù)以±s表示。MASCOT是數(shù)據(jù)庫檢索軟件,質(zhì)譜分析中以MASCOT評(píng)分作為一個(gè)直觀的數(shù)值來評(píng)價(jià)一個(gè)結(jié)果是否可信,Mascot分?jǐn)?shù)高低取決于數(shù)據(jù)庫的大小與設(shè)定的P值,我們以MASCOT評(píng)分＞65,P＜0.05認(rèn)定結(jié)果可信,以得分最高的蛋白作為匹配蛋白。

結(jié)果

一、凝集與非凝集性生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)特征

低傳代DPC呈現(xiàn)凝集性生長(zhǎng)特征(圖1a),第6代后的DPC呈梭形,表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞形態(tài),不出現(xiàn)凝集性生長(zhǎng)特征,為非凝集性生長(zhǎng)DPC(圖1b)。

圖1 毛乳頭細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài) 1a:凝集生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞,細(xì)胞呈現(xiàn)聚集成細(xì)胞團(tuán)的生長(zhǎng)特點(diǎn);1b:非凝集生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞,細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞特點(diǎn),呈梭形,非聚集生長(zhǎng)

二、雙向電泳結(jié)果

本研究建立了重復(fù)性較好、分辨率較高的雙向凝膠電泳銀染圖譜(圖2)。在凝集生長(zhǎng)和非凝集生長(zhǎng)的DPC分泌性蛋白質(zhì)中分別檢測(cè)到(1 134±52)個(gè)和(1 078±36)個(gè)蛋白點(diǎn),各點(diǎn)清晰獨(dú)立。差異蛋白點(diǎn)主要集中在分子量較低的蛋白質(zhì),與分泌性蛋白質(zhì)的特點(diǎn)相吻合。按照差異量在5倍以上的標(biāo)準(zhǔn),凝集生長(zhǎng)和非凝集生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞存在差異蛋白質(zhì)28個(gè)。

圖2 毛乳頭細(xì)胞分泌性差異蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜,二者大多匹配,差異點(diǎn)主要集中在低分子量蛋白質(zhì),在此區(qū)域凝集生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞的蛋白點(diǎn)數(shù)高于非凝集生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞 2a:凝集生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞;2b:非凝集生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞

三、質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索

通過MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀鑒定差異蛋白點(diǎn),11個(gè)蛋白點(diǎn)獲得很好的PMF圖譜,與10個(gè)蛋白質(zhì)相匹配(表1),其中8種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),分別為Rho GDP分離抑制劑1(Rhogdi 1)、細(xì)絲蛋白A、胱抑素C、纖維連接蛋白、親環(huán)素A、前膠原C端蛋白酶增強(qiáng)子(PCPE-1)、組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)、組織金屬蛋白酶-2抑制劑(TIMP-2);2種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào),為神經(jīng)肽h3和基質(zhì)金屬蛋白酶-3金屬蛋白酶組織抑制劑-1復(fù)合物(Mmp-3TIMP-1)復(fù)合物。根據(jù)質(zhì)譜鑒定信息查詢數(shù)據(jù)庫,這些差異蛋白質(zhì)主要參與了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)合成及降解等生理過程等。

表1 凝集生長(zhǎng)和非凝集生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞質(zhì)譜鑒定的差異分泌蛋白質(zhì)

討論

毛乳頭是毛囊生長(zhǎng)和毛發(fā)周期的控制中心,毛乳頭細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)決定其生理功能,因此研究凝集和非凝集生長(zhǎng)狀態(tài)下毛乳頭細(xì)胞蛋白表達(dá)差異有助于闡明毛乳頭在毛囊生長(zhǎng)和周期調(diào)控中的作用。比較蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成功用于分泌性蛋白質(zhì)組研究[4]。本實(shí)驗(yàn)中,我們應(yīng)用比較蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)凝集和非凝集生長(zhǎng)狀態(tài)下毛乳頭細(xì)胞分泌的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究,在多次探索實(shí)驗(yàn)條件后,根據(jù)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行雙向電泳,獲得了重復(fù)性較好、分辨率較高的雙向凝膠電泳銀染圖譜。在凝集和非凝集生長(zhǎng)的DPC分泌性蛋白質(zhì)中分別檢測(cè)到(1 134± 52)個(gè)和(1 078±36)個(gè)蛋白點(diǎn),各點(diǎn)清晰獨(dú)立。按照差異量在5倍以上的標(biāo)準(zhǔn),凝集生長(zhǎng)和非凝集生長(zhǎng)毛乳頭細(xì)胞存在差異蛋白質(zhì)28個(gè),其中11個(gè)獲得良好的肽質(zhì)量指紋譜,與10種蛋白質(zhì)相匹配,8種蛋白質(zhì)在凝集性生長(zhǎng)狀態(tài)下表達(dá)上調(diào),2種蛋白質(zhì)在凝集性生長(zhǎng)條件下表達(dá)下調(diào)。通過數(shù)據(jù)庫查詢得知,這些差異蛋白質(zhì)主要參與了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)合成及降解等生理過程等。

由于DPC分泌性蛋白質(zhì)以低豐度的形式存在,增加了通過雙向電泳進(jìn)行分析的難度,為此我們采用了與質(zhì)譜兼容的銀染法,在保證蛋白較好分離的基礎(chǔ)上增加了敏感性。本實(shí)驗(yàn)鑒定的10種差異蛋白質(zhì)中5種蛋白質(zhì)參與信號(hào)通路、細(xì)胞增殖與分化,包括細(xì)絲蛋白、纖維連接蛋白、胱抑素C、親環(huán)素A和Rho GDI 1。細(xì)絲蛋白參與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)信號(hào)通路[5];纖維連接蛋白和胱抑素C參與細(xì)胞增殖等[6-7]。親環(huán)素A參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),維持發(fā)育中或變性蛋白質(zhì)的正確結(jié)構(gòu)[8]。Rho GDI 1參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)控[9]。4種蛋白質(zhì)為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,包括 TIMP、TIMP-2、Mmp-3TIMP-1和PCPE-1,在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成和降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10-11]。我們推測(cè),這些信號(hào)分子和基質(zhì)蛋白可能與毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長(zhǎng)和毛囊生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。

神經(jīng)肽是存在于神經(jīng)組織并參與神經(jīng)系統(tǒng)功能作用的一類特殊的信息物質(zhì),神經(jīng)肽h3曾在肺癌組織中被發(fā)現(xiàn)[12],未見于其他組織和細(xì)胞。本研究中神經(jīng)肽h3的出現(xiàn)是否與毛乳頭生長(zhǎng)相關(guān)尚不清楚,需要深入探討。

[1]McElwee KJ，Hoffmann R.Growth factors in early hair follicle morphogenesis[J].Eur J Dermatol，2000，10(5):341-350.

[2]夏汝山，郝飛，楊希川，等.毛乳頭細(xì)胞分泌性蛋白質(zhì)組的制備[J].中華皮膚科雜志，2013，46(2):57-58.

[3]G?rg A，Obermaier C，Boguth G，et al.T he current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients [J].Electrophoresis，2000，21(6):1037-1053.

[4]楊立群，陳曉棟，姚曉東.非標(biāo)記定量技術(shù)研究瘢痕疙瘩的蛋白質(zhì)組學(xué)特點(diǎn)[J].中華皮膚科雜志，2012，45(3):173-177.

[5]Uribe R，Jay D.A review of actin binding proteins:new perspectives [J].Mol Biol Rep，2009，36(1):121-125.

[6]Singh P，Schwarzbauer JE.Fibronectin and stem cell differentiationlessons from chondrogenesis[J].J Cell Sci，2012，125(Pt 16): 3703-3712.

[7]Korolenko TA.Cystatins:biological role and changes in pathology [J].Vestn Ross Akad Med Nauk，2008，(4):43-47.

[8]Lee J.Role of cyclophilin a during oncogenesis[J].Arch Pharm Res，2010，33(2):181-187.

[9]DovasA，CouchmanJR.RhoGDI:multiplefunctionsintheregulation of Rho family GTPase activities[J].Biochem J，2005，390(Pt 1): 1-9.

[10]Weiss T，Ricard-Blum S，Moschcovich L，et al.Binding of procollagen C-proteinase enhancer-1 (PCPE-1)to heparin/ heparan sulfate:properties and role in PCPE-1 interaction with cells[J].J Biol Chem，2010，285(44):33867-33874.

[11]Wasilewska A，Taranta-Janusz K，Zoch-Zwierz W，et al.Role of matrix metalloproteinases(MMP)and their tissue inhibitors (TIMP)in nephrology[J].Przegl Lek，2009，66(9):485-490.

[12]羅國安，鄧斌，葉能勝，等.肺鱗癌和小細(xì)胞肺癌組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(9):1645-1649.

2014-01-01)

(本文編輯:吳曉初)

A preliminary analysis of the secretome of aggregated dermal papilla cells

Xia Rushan，Gu Jing，Tao Shiqin，Yang Lijia.Department of Dermatology，Wuxi No.2 People′s Hospital，Nanjing Medical University，Wuxi 214002，Jiangsu，China

Yang Lijia，Email:yanglijia726@163.com

ObjectiveTo study the expression of secreted proteins in aggregated dermal papilla cells (DPCs).MethodsDPCs were isolated from human scalp tissue and subjected to primary culture and subculture. Aggregated and non-aggregated DPCs served as the subject of this study.Secreted proteins were prepared from these cells and subjected to two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.Differentially expressed proteins were screened by the PDQuest image analysis software.Protein spots were digested and identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight(MALDI-TOF)mass spectrometry，and finally analyzed using the National Center forBiotechnologyInformation (NCBI)non-redundant(Nr)proteindatabase.ResultsTwo-dimensional electrophoresis maps with good repeatability and high resolution were established.Image analysis of 2-D gels revealed that the average number of detected protein spots was 1 134±52 and 1 078±36 in aggregated and nonaggregated DPCs respectively，and the majority of these protein spots were matched between aggregated and nonaggregated DPCs.Twenty-eight protein spots showed more than 5-fold difference between the two groups of cells，and 10 proteins were preliminarily identified as differentially expressed proteins by peptide-mass fingerprinting.Of these differentially expressed proteins，8 proteins including Rhogdi 1，filamin A，cystatin C，fibronectin，cyclophilin A，procollagen C proteinase enhancer 1，tissue inhibitor of metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 were up-regulated，and 2 proteins including neuropolypeptide h3 and matrix metalloproteinase-3/tissue inhibitor of metalloproteinase-1 complex were down-regulated in aggregated DPCs compared with non-aggregated DPCs.ConclusionsDifferentially expressed proteins between aggregated and non-aggregated DPCs are mainly implicated in cell signaling pathway，cellular proliferation and differentiation，extracellular matrix synthesis and degradation，and so on.

Dermal papilla cells;Secretory proteins;Electrophoresis，gel，two-dimensional;MALDI-TOF mass spectrometry

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.003

南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金(2011NJMUZ05);無錫市衛(wèi)生局科研計(jì)劃項(xiàng)目(ML201202)

214002江蘇無錫,南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市第二人民醫(yī)院皮膚科

楊莉佳,Email:yanglijia726@163.com