5種“發(fā)物”對小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型的影響

胡陽 ，孫越 ，李婷 ，陳向明 ，張海清 ，俞愛華 ，王國江

（1.上海市嘉定區(qū)南翔醫(yī)院，上海201802；2.上海市交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海200080）

中醫(yī)文獻中“發(fā)物”多指辛辣、海鮮、葷腥厚味食物[1]，此類食物可能是導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)性皮膚病加重、反復(fù)難愈的因素之一[2]。中醫(yī)將容易激發(fā)宿疾復(fù)發(fā)或加重現(xiàn)有疾病的食物稱為“發(fā)物”，且十分重視對“發(fā)物”的忌口。但由于缺乏客觀指標，“發(fā)物”忌口的科學(xué)性常受到質(zhì)疑。變應(yīng)性接觸性皮炎（Allergic contact dermatitis，ACD）是接觸性變應(yīng)原引起的一種Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)，是臨床常見的炎癥性皮膚病。本研究利用2，4-二硝基氟苯（DNFB）誘導(dǎo) BALB/c小鼠ACD模型，觀察羊肉、帶魚、青椒、香菇、竹筍5種傳統(tǒng)“發(fā)物”對其皮膚損害及相關(guān)細胞因子的影響，并探討可能的作用機制，從而對傳統(tǒng)中醫(yī)“發(fā)物”理論進行實驗論證，為臨床指導(dǎo)患者合理的飲食提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級雌性BALB/C小鼠,體質(zhì)量18～22 g（上海斯萊克動物中心提供）。實驗動物合格證號：scxk（滬）2008-0016。在一定的溫度和濕度環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周進行實驗。

1.2 實驗試劑 DNFB（上海化學(xué)試劑公司），丙酮（上海試劑廠）。小鼠γ-干擾素（IFN-γ），白細胞介素（IL-17）ELISA試劑盒（美國R&D公司，上?？婆d生物公司代購，批號20121102）。

1.3 實驗儀器 電子分析天平（精確度0.1 mg，上海精密科學(xué)儀器有限公司FA1004），皮膚圓形打孔器（直徑 8 mm），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS B×43F）及成像系統(tǒng)（micropublisher3.3RTV，QIMAGING ROHS，CANADA）。BIO-TEK 酶標儀（型號 ELX-800）。

1.4 實驗分組及方法 78只小鼠隨機分成羊肉組、帶魚組、香菇組、青椒組、竹筍組、對照組、正常組，前6組每組12只小鼠，參照文獻[3]制作經(jīng)典ACD小鼠模型。實驗前1 d，腹部剃毛，面積約3 cm2，實驗1 d和2 d分別在去毛部位涂0.5%DNFB（溶劑為丙酮∶橄欖油＝4∶1的混合液）20 μL各致敏 1次，實驗6 d在小鼠右耳內(nèi)外側(cè)涂0.2%DNFB 10 μL，激發(fā)ACD。左耳涂等量丙酮橄欖油基質(zhì)作對照。正常組6只小鼠為健康小鼠。羊肉、竹筍、帶魚、青椒、香菇各500 g，煎煮濃縮至2 g/mL，分別對相應(yīng)組別小鼠進行灌胃，首次灌胃于激發(fā)前1 d，1次/d，每次量以0.02 mL/g計算。對照組用等量純水灌胃。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 耳厚度 分別于激發(fā)后24，48 h處死小鼠，用直徑8 mm的打孔器，分別鉆取左右耳中部的組織，將鉆下耳組織制成HE染色切片。參照文獻[4]在光學(xué)成像顯微鏡100倍鏡下，采用Q-capture pro7圖像處理軟件，測量組織切片中距耳緣端4 mm處的耳雙面距離,垂直于軟骨進行測量，每只耳測量5次，取平均值，計算激發(fā)后小鼠左、右耳厚度差。

1.5.2 真皮單一核及多形核細胞總數(shù) 將鉆取的右耳組織制成HE染色切片，每張HE切片在光鏡顯微鏡400倍鏡下，取5個不重疊視野，進行炎癥細胞數(shù)量計數(shù)，取平均值。

1.5.3 外周血IFN-γ、IL-17檢測 分別于激發(fā)后24，48 h摘眼球取血1 mL，離心后分離血清，低溫冰箱保存?zhèn)溆?。ELISA法檢測小鼠外周血IFN-γ、IL-17水平，檢測步驟按試劑盒說明書進行，將反應(yīng)板放入酶標儀于450 nm波長處測各孔吸光度值，通過標準曲線計算各孔IFN-γ、IL-17的濃度值（單位為 mg/L）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用graphpad prism 5統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，“發(fā)物”各組與對照組及正常組間均數(shù)比較采用Dunnett-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耳厚度 激發(fā)后24 h，“發(fā)物”各組耳腫脹與對照組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；激發(fā)后48 h，羊肉、青椒組耳腫脹較對照組顯著增高（P＜0.05），帶魚、竹筍、香菇組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1。

2.2 炎癥細胞計數(shù) 與對照組比較，激發(fā)后24 h羊肉組耳組織炎癥細胞計數(shù)明顯增多（P＜0.05），激發(fā)后48 h，羊肉、青椒組炎癥細胞均顯著增多（P＜0.05），帶魚、竹筍、香菇組24 h及48 h與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1

表1 激發(fā)后24，48 h耳腫脹及炎癥細胞計數(shù) （±s）

表1 激發(fā)后24，48 h耳腫脹及炎癥細胞計數(shù) （±s）

注：*與對照組相比P＜0.05。

組別 n 耳腫脹（μm） 炎癥細胞計數(shù)24 h 48 h 24 h 48 h對照組 6 179.03±26.84 177.73±24.64 112.89±24.59 119.24±18.04羊肉組 6 220.61±36.99 278.58±45.48*143.65±31.06*189.38±42.68*帶魚組 6 204.18±38.22 212.38±34.25 119.91±20.55 126.34±23.46香菇組 6 200.68±29.33 204.19±29.61 128.81±20.91 123.63±10.94青椒組 6 207.87±14.58 271.99±64.68*135.31±11.02 196.22±56.64*竹筍組 6 175.38±25.67 172.32±25.09 113.38±25.67 115.24±65.02 F值 2.45 11.54 3.84 28.63 P 值 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 外周血IFN-γ、IL-17水平變化 與正常組相比，誘導(dǎo)小鼠ACD后，各組IFN-γ、IL-17均明顯升高（P＜0.05）。與對照組相比，竹筍組 IFN-γ、IL-17 水平明顯降低（P＜0.05），帶魚、香菇組兩種細胞因子差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），羊肉、青椒組 24 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），48 h IFN-γ、IL-17 水平顯著增加（P＜0.05）。見表 2。

表2 激發(fā)后24，48 h小鼠血清IFN-γ、IL-17水平變化

3 討論

長期以來，皮膚病患者的飲食忌口很多，但大多是根據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗，或不明飲食禁忌，導(dǎo)致疾病加重，或盲目忌口造成營養(yǎng)失衡，免疫力下降，影響疾病的恢復(fù)。羊肉、帶魚、青椒、香菇、竹筍是常用食物，也是中醫(yī)傳統(tǒng)認為的“發(fā)物”。研究表明花生四烯酸、前列腺素等重要變應(yīng)性活性介質(zhì)是由n-6族脂肪酸轉(zhuǎn)變而來，n-3不飽和脂肪酸在特應(yīng)性發(fā)病中是一個有利的因素[5]。羊肉中含有花生四烯酸，海鮮中含有n-3不飽和脂肪酸。青椒中辣椒素可導(dǎo)致血管擴張等神經(jīng)源性炎癥效應(yīng)。香菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用。竹筍具有低脂肪、低糖、高纖維素等特點。本研究觀察其對小鼠ACD模型的影響，并探討可能的作用機制。DNFB腹部誘導(dǎo)，耳廓激發(fā)小鼠模型是目前最為常用的ACD動物模型，該模型可用于評估食品及其中成分對過敏性疾病的干預(yù)研究[6]。ACD是一種以炎癥細胞浸潤及組織變性壞死為主要病理特征的炎性反應(yīng)。耳厚度及單位面積單一核及多形核細胞浸潤數(shù)量變化是反應(yīng)ACD嚴重程度的常用指標。從研究結(jié)果來看羊肉、青椒能明顯加重小鼠耳廓炎癥腫脹，增加局部炎癥細胞浸潤，48 h時尤為顯著，表現(xiàn)出有加重小鼠ACD作用。帶魚、竹筍、香菇組對小鼠ACD炎癥程度無明顯影響。

ACD是T淋巴細胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，研究證明Th1和Th17細胞在ACD的發(fā)病過程中均起重要作用。其各自分泌的IFN-γ和IL-17均為ACD效應(yīng)階段重要的細胞因子。IFN-γ是最有效的巨噬細胞激活因子，能活化多種細胞，調(diào)節(jié)多種免疫活性介質(zhì)的合成和分泌，加重炎癥反應(yīng)。He等[7]研究發(fā)現(xiàn) IFN-γ通過刺激和調(diào)節(jié) ROS（Reactive oxygen species，ROS）的活性而影響ACD反應(yīng)。IL-17能誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生多種炎性因子（如IL-6、IL-8等），調(diào)節(jié)趨化因子 CXCL1及黏附分子ICAM-1表達，促進中性粒細胞活化和向炎癥部位募集，加重局部炎癥反應(yīng)[7-8]。通過檢測外周血細胞因子發(fā)現(xiàn)，激發(fā)ACD后各組IFN-γ、IL-17水平較正常小鼠均有不同程度的升高，并與ACD嚴重程度平行。與對照組相比，羊肉、青椒組48 h時IFN-γ、IL-17的釋放明顯增加，其加重小鼠ACD的作用可能與此有關(guān)。竹筍組2種細胞因子表達明顯下降，但其對小鼠ACD炎癥無抑制作用，是否與喂食時間及樣本量有關(guān)，有待進一步研究。帶魚、香菇對兩種細胞因子均無明顯影響。

變態(tài)反應(yīng)性皮膚病中醫(yī)辨證多與血熱，風(fēng)熱、濕毒有關(guān)，本研究結(jié)果顯示，對此類疾病，羊肉、青椒溫熱性食物，與中醫(yī)“發(fā)物”吻合。

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