康丹丹,湯建民
鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州450014
解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein-2,UCP2)是位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的載體蛋白,介導(dǎo)氧化磷酸化與ATP 合成解偶聯(lián),抑制活性氧的生成[1],保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激,對(duì)抗心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是NO 合成的限速酶,內(nèi)皮型NOS(epidermal nitric oxide synthase,eNOS)和誘導(dǎo)型NOS(induced nitric oxide synthase,iNOS)是與MIRI 有關(guān)的主要NOS 亞型。隨著研究的不斷深入,近年來(lái)提出了藥物預(yù)適應(yīng)(pharmacological ischemic preconditioning,PIP)這一概念。國(guó)內(nèi)外研究[2-4]證實(shí),藥物預(yù)處理對(duì)MIRI 具有保護(hù)作用。目前關(guān)于UCP2 的研究大多基于缺血缺氧刺激,有關(guān)PIP 與UCP2 的研究則較少,而有關(guān)iNOS 與PIP 的研究則罕見(jiàn)報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠缺血再灌注損傷模型,檢測(cè)心肌組織UCP2 及iNOS 的表達(dá),進(jìn)一步探討依那普利預(yù)處理對(duì)心肌的保護(hù)機(jī)制,為藥物治療提供線(xiàn)索及依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康成年SD 雄性大鼠35只,購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體重250~300 g,適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。將大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)7只、缺血再灌注組(IR組)14只、依那普利預(yù)處理組(PIP組)14只。PIP組給予依那普利10 mg/(kg·d)灌胃,余給予生理鹽水2 mL/d 灌胃。預(yù)處理1 周后制作大鼠MIRI 模型,獲得Sham組6只、IR組8只、PIP組9只。
1.2 試劑 依那普利片(10 mg)由揚(yáng)子江有限公司提供,RT 試劑盒、PCR 試劑盒、Marker 由Transgene 公司提供,ECL 試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供,小鼠抗大鼠UCP2 抗體、羊抗大鼠iNOS 抗體、GAPDH 抗體由Santa Cruz 公司提供,二抗由Zymed 公司提供。
1.3 儀器 小型動(dòng)物呼吸機(jī)(型號(hào):Inspira)由北京創(chuàng)博環(huán)球生物科技有限公司提供,小動(dòng)物心電圖機(jī)(型號(hào):SBP-2000)由上海茂生生物科技發(fā)展有限公司提供,D-140 圖像記錄分析系統(tǒng)由大連競(jìng)邁儀器有限公司提供,PCR 擴(kuò)增儀、EP 管由Eppendorf 公司提供。
1.4 模型建立及心肌標(biāo)本采集 用體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛按3 mL/kg 腹腔注射,麻醉成功后,固定大鼠,連接心電圖機(jī)于四肢皮下。氣管切開(kāi)插管,呼吸機(jī)輔助呼吸,潮氣量20 mL/kg,頻率60~70次/min。開(kāi)胸暴露心臟,剪開(kāi)心包,擠出心臟,于左心耳根部冠狀動(dòng)脈起始處用5 號(hào)絲線(xiàn)穿過(guò)該動(dòng)脈。Sham組只穿線(xiàn)不結(jié)扎,余2組將一帶有凹槽的細(xì)乳膠管墊于血管與結(jié)扎線(xiàn)之間,結(jié)扎30 min,剪開(kāi)結(jié)扎線(xiàn),取出細(xì)乳膠管,關(guān)胸后再灌注120 min。模型成功標(biāo)準(zhǔn):結(jié)扎線(xiàn)遠(yuǎn)端的缺血心肌變白,顏色變暗,心電圖上QRS 波增寬增高[5]或伴ST 段抬高,證實(shí)左前降支結(jié)扎成功。再灌注后缺血部位心肌顏色恢復(fù),QRS 波振幅減低,抬高的ST 段回落,證實(shí)結(jié)扎血管再灌注成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取心臟,獲取左室缺血區(qū)心肌組織,分為2 份,用預(yù)冷的PBS 鹽水洗凈殘血,1 份在液氮中迅速冷凍,2 份均存放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.5 血清磷酸激酶(CK)活性和丙二醛(MDA)含量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采取2 mL 心室血,4 000 r/min離心10 min 后取血清,全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清CK 活性及MDA 含量。
1.6 心肌組織UCP2 和iNOS mRNA 檢測(cè) UCP2上游引物5'-TCCTGGCAGGTAGCACCA-3',下游引物5'-CCCGAAGGCAGAAGTGAAG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小為311 bp。iNOS 上游引物5'-GCTGTCTGACCCTCA TTTT-3',下游引物5'-GCTGTCTGACCCTCATTTT-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小為180 bp。GAPDH 上游引物5'-CCACGGCAAGTTCAACGGCACA-3',下游引物5'-GCGGCATGTCAGATCCACAACG-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小為589 bp。取心肌組織100 mg,用Trizol 法提取組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以2 μL cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸2 min,共35個(gè)循環(huán);72℃總延伸6 min。取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,EB 染色。目的基因的相對(duì)表達(dá)量以目的基因和GAPDH 條帶的灰度值之比來(lái)表示。
1.7 心肌組織UCP2 和iNOS 蛋白檢測(cè) 按每20 mg 心肌組織加100~200 μL 的比例加入蛋白裂解液,4 000 r/min 離心5 min,取上清液獲得組織蛋白。蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的麗春紅染色,剪下帶有Marker 條帶的膜和濾紙,在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡30 min。除去氣泡后合上夾子,倒入轉(zhuǎn)移槽中,100 V 電壓轉(zhuǎn)移80 min,質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉TBST 封閉2 h。將一抗按1 ∶1 000 稀釋加入膜上,4℃搖床過(guò)夜孵育,TBST 沖洗3次,分別為15、10、5 min。將膜與二抗按1∶4 000 稀釋?zhuān)?7℃恒溫床孵育45 min,TBST 沖洗3次,每次5 min。用ECL 顯色,將膠片掃描后用Bandscan 5.0 進(jìn)行灰度分析。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 分析數(shù)據(jù)。各組CK 活性、MDA 含量、UCP2 和iNOS mRNA 與蛋白表達(dá)的比較均采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
2.1 血清CK 活性和MDA 含量 與Sham組相比,IR組及PIP組血清CK 和MDA 含量升高,而PIP組較IR組降低(表1)。
表1 各組大鼠血清CK 活性、MDA 含量比較
2.2 心肌組織UCP2 表達(dá) 與Sham組相比,IR組及PIP組心肌組織UCP2 蛋白、mRNA 表達(dá)升高;PIP組較IR組降低。見(jiàn)圖1、2 和表2。
圖1 各組大鼠心肌組織UCP2 及iNOS 蛋白的表達(dá)
圖2 各組大鼠心肌組織UCP2 mRNA 的表達(dá)
2.3 心肌組織iNOS 表達(dá) 與Sham組相比,IR組及PIP組心肌組織iNOS 蛋白、mRNA 表達(dá)升高;PIP組較IR組進(jìn)一步升高。見(jiàn)圖1、3 和表2。
表2 各組大鼠心肌組織UCP2、iNOS 蛋白及mRNA 表達(dá)的比較
圖3 各組大鼠心肌組織iNOS mRNA 的表達(dá)
氧自由基爆發(fā)[6]是引起MIRI 的重要作用機(jī)制之一,氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧可以上調(diào)及激活UCP2的表達(dá)。Krauss 等[7]把超氧化物加入分離的線(xiàn)粒體中,發(fā)現(xiàn)其激活UCP2 介導(dǎo)的質(zhì)子漏。UCP2 通過(guò)解偶聯(lián)作用抑制活性氧的生成,被譽(yù)為體內(nèi)抗氧化因子。該實(shí)驗(yàn)觀察到IR組代表氧化應(yīng)激引起細(xì)胞損傷[8]的指標(biāo)MDA 含量升高,同時(shí)UCP2 表達(dá)也升高;與IR組相比,PIP組血清MDA 含量、CK 活性降低,UCP2 表達(dá)降低,說(shuō)明氧化應(yīng)激減弱,心肌細(xì)胞損傷減少,證明依那普利具有對(duì)抗MIRI 的作用。依那普利預(yù)處理的確切作用機(jī)制尚不清楚,可能與其抑制AngⅡ誘發(fā)的活性氧生成有關(guān)[9]。依那普利抑制UCP2 表達(dá)上調(diào),是通過(guò)減少缺血區(qū)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激起作用。
MIRI 引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,舒血管物質(zhì)與縮血管物質(zhì)比例失調(diào)。內(nèi)源性NO 是一類(lèi)舒血管活性物質(zhì),其合成受iNOS 的調(diào)節(jié)。生理?xiàng)l件下iNOS 無(wú)活性,正常組織也較少表達(dá)。在缺血缺氧、炎癥刺激等病理?xiàng)l件下則開(kāi)始表達(dá)[10],催化生成NO 參與MIRI的調(diào)節(jié),NO 發(fā)揮心肌毒性或心肌保護(hù)的作用主要取決于NO 的釋放量。研究[11]表明緩激肽可激活NOS促進(jìn)NO 合成,并通過(guò)NO-cGMP 途徑或其他途徑實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)作用,更有學(xué)者[12]認(rèn)為某些心血管疾病的發(fā)生與緩激肽受體調(diào)節(jié)有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,IR組iNOS 表達(dá)升高,證明缺血缺氧刺激可誘導(dǎo)其表達(dá)。給予依那普利預(yù)處理后其活性進(jìn)一步升高,同時(shí)反映心肌損傷的指標(biāo)CK 活性降低,說(shuō)明依那普利通過(guò)增強(qiáng)iNOS 活性減輕MIRI。這一作用機(jī)制可能與其抑制AngⅡ生成,減少緩激肽降解,保留其更多生物活性,促進(jìn)iNOS 產(chǎn)生更多NO 有關(guān)。
總之,依那普利預(yù)處理可能通過(guò)下調(diào)UCP2、上調(diào)iNOS 的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)其心肌保護(hù)作用。由于該研究未進(jìn)行與藥物作用機(jī)制、目的蛋白有關(guān)因子的研究,致使對(duì)其作用機(jī)制的推測(cè)有一定的局限性。
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