王舒雨,趙明蕊,王俊巍,李云飛,岳小欣
1)河南醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校藥學(xué)系 鄭州451191 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院新藥研發(fā)中心 鄭州450001
蟾皮為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍等的皮,蟾毒噻嚀是其主要化學(xué)成分之一?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[1]表明,蟾皮中的化學(xué)成分具有抗腫瘤、抗乙肝病毒的藥理作用。蟾皮臨床上主要用于治療乙型肝炎、慢性支氣管炎以及消除癰瘡和褪毒止痛,近年來(lái)亦用于多種癌癥的治療和輔助治療,具有縮小瘤塊、消除腹水和減緩癌癥轉(zhuǎn)移擴(kuò)散速度的作用。在配合放、化療的過(guò)程中,蟾皮不僅能夠提高療效,還能減輕副作用、改善血常規(guī)[2]。作者使用超臨界CO2萃取法提取干蟾皮中的蟾毒噻嚀,觀察蟾毒噻嚀對(duì)腫瘤細(xì)胞株ECa109、HepG2、A549 生長(zhǎng)及凋亡的影響,同時(shí)觀察其對(duì)S180 荷瘤鼠腹水瘤的抑制作用,探討蟾毒噻嚀的抗腫瘤作用。
1.1 材料 ECa109、HepG2、A549 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。干蟾皮購(gòu)于河南鄭州,由河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科主管藥師趙婭鑒定為中華大蟾蜍的干燥皮。昆明小鼠,雌雄各半,18~22 g,購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。體積分?jǐn)?shù)95%乙醇(分析純,鄭州光明化工有限公司),RPMI 1640 培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco 公司),胰蛋白酶(碧云天公司),DMSO(Sigma Aldrich 公司),MTT 試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和水平流凈化工作臺(tái)(Thermo Forma 公司),倒置顯微鏡(Olympus 公司),高速低溫離心機(jī)(Beckman Coulte 公司),Accuri C6 型流式細(xì)胞儀(BD 公司),Power Wave XS2 酶標(biāo)儀(BioTek 公司),LE ICA RM 2235 型石蠟切片機(jī)(浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠),DL80-2B 型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。
1.2 蟾皮中蟾毒噻嚀的提取 以無(wú)水乙醇為提取溶劑,采用響應(yīng)面法研究超臨界CO2萃取干蟾皮中蟾毒噻嚀的最佳工藝條件為:萃取溫度45℃,萃取壓力40 MPa,CO2流量10 kg/h。在此條件下蟾毒噻嚀收率為2.36%,純度為98%。
1.3 蟾毒噻嚀對(duì)3種腫瘤細(xì)胞增殖的影響 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為8 ×104mL-1,每孔0.1 mL 接種于96 孔板,置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)24 h。每種細(xì)胞均分為9組。將蟾毒噻嚀溶于DMSO 中,用培養(yǎng)基稀釋,使藥物終質(zhì)量濃度為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000、32.000 mg/L,對(duì)照組加入含體積分?jǐn)?shù)0.1%DMSO 的無(wú)血清培養(yǎng)基[3]。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后,取出細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入MTT溶液20 μL,繼續(xù)孵育4 h 后每孔加入150 μL DMSO,并于562 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值(OD值)。細(xì)胞抑制率=[(對(duì)照組OD 值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD 值]×100%。根據(jù)不同質(zhì)量濃度的藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率,計(jì)算細(xì)胞的半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(IC50)。
1.4 蟾毒噻嚀對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響 收集4、2、1 mg/L 蟾毒噻嚀處理過(guò)的HepG2 細(xì)胞約(1~5)× 106mL-1,即高、中、低劑量組,500~1 000 r/min 離心5 min,棄去培養(yǎng)液。3 mL PBS 洗滌1次。離心去PBS 后加入冰預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇4℃固定1~2 h。離心棄去固定液,3 mL PBS重懸5 min。400 目篩網(wǎng)過(guò)濾,500~1 000 r/min 離心5 min,棄去PBS。加入1 mL 混合后的PI 和Annexin-V FITC 染液,4℃避光染色30 min 后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)[4-5],觀察細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布。
1.5 蟾毒噻嚀對(duì)S180 荷瘤鼠腹水瘤的影響 凍存的S180 瘤株37℃水浴后1 000 r/min 離心5 min,棄上清,將下層細(xì)胞用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1 ×107mL-1。取小鼠,腹腔注射S180 細(xì)胞懸液0.3 mL。接種第7天,無(wú)菌條件下抽取S180 荷瘤小鼠腹腔中乳白色腹水3~5 mL,1 000 r/min 離心5 min,棄上清,下層細(xì)胞用無(wú)菌PBS(pH 7.4)洗滌3次后,稀釋100 倍,加無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1 ×107mL-1。在無(wú)菌操作下進(jìn)行傳代。傳至第4代后抽取腹水,同上處理調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×107mL-1。另取100只小鼠,腹腔注射上述細(xì)胞懸液0.3 mL 后按隨機(jī)數(shù)字表分為5組,陰性對(duì)照組每日注射0.01 mL/g 生理鹽水,陽(yáng)性對(duì)照組注射20 mg/kg 5-FU,蟾毒噻嚀高、中、低劑量組分別注射30、20、15 mg/kg 蟾毒噻嚀,連續(xù)7 d。給藥期間,每天觀察荷瘤鼠的生存情況,隔天稱體重、測(cè)腹圍。
末次給藥后各組處死半數(shù)小鼠,在無(wú)菌條件下用注射器收集腹腔中全部腹水,測(cè)體積,計(jì)算腹水抑制率。腹水抑制率=[1 -治療組腹水量/陰性對(duì)照組腹水量]×100%。取新鮮腹水0.4 mL,1 000 r/min 離心5 min,棄去上層組織液,下層細(xì)胞用無(wú)菌PBS(pH 7.4)洗滌3次,稀釋100 倍,加入臺(tái)盼藍(lán)染液染色3 min(V臺(tái)盼藍(lán)染液∶V細(xì)胞懸液=1∶10),用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在光鏡下記錄細(xì)胞數(shù),計(jì)算瘤細(xì)胞存活率。瘤細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。給藥結(jié)束后,未處死的半數(shù)小鼠觀察生存時(shí)間,計(jì)算生命延長(zhǎng)率。生命延長(zhǎng)率=[(給藥組生存時(shí)間/陰性對(duì)照組生存時(shí)間)-1]×100%。
剖取荷瘤鼠肝臟,中性甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋切片,HE 染色,普通顯微鏡下觀察肝組織的病理變化。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0 處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較不同劑量蟾毒噻嚀對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的抑制率及各組荷瘤鼠腹水抑制率、瘤細(xì)胞存活率和生命延長(zhǎng)率,兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
2.1 蟾毒噻嚀對(duì)細(xì)胞增殖的影響 隨著藥物質(zhì)量濃度的增大,蟾毒噻嚀對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng),其中對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng),結(jié)果見表1。蟾毒噻嚀對(duì)ECa109、HepG2、A549 細(xì)胞的IC50分別為(7.589 ±1.193)、(2.337 ±0.379)和(6.940 ±0.900)mg/L。
表1 不同劑量蟾毒噻嚀對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的抑制率 %
2.2 蟾毒噻嚀對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 根據(jù)MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇細(xì)胞抑制作用最顯著的HepG2 細(xì)胞觀察細(xì)胞凋亡和周期分布。結(jié)果顯示蟾毒噻嚀高、中、低劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)均多于陰性對(duì)照組,且可將細(xì)胞周期阻滯在G2期。
2.3 各組荷瘤鼠生命延長(zhǎng)率、腹水抑制率、瘤細(xì)胞存活率比較 見表2。
表2 各組荷瘤鼠生命延長(zhǎng)率、腹水抑制率、瘤細(xì)胞存活率比較 %
2.4 肝臟組織學(xué)觀察 見圖1。剖取各組動(dòng)物肝臟,肉眼可見肝臟顏色偏黃,各葉之間未見粘連,質(zhì)地較堅(jiān)韌,表面可見黏性物質(zhì),切面未見明顯充血、壞死灶等病理改變。鏡下見陰性對(duì)照組腫瘤組織內(nèi)癌細(xì)胞數(shù)量多,排列緊密,異形性明顯,核大、深染,核漿比明顯異常,細(xì)胞出現(xiàn)空泡型變性,多數(shù)肝細(xì)胞壞死;各治療組腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)程度較輕,異形細(xì)胞減少,肝臟細(xì)胞接近正常,見圖1。
圖1 各組荷瘤鼠肝臟的病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(HE,×400)
該研究主要觀察了蟾毒噻嚀的抗腫瘤作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,蟾毒噻嚀對(duì)HepG2、A549、ECa109細(xì)胞均有較好的抑制作用,其中對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的凋亡和周期進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)蟾毒噻嚀能夠誘發(fā)肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡,并初步推測(cè)其將細(xì)胞周期阻滯于G2期。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[6]表明蟾毒噻嚀能明顯改善荷瘤鼠的生存狀態(tài),延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存期。該研究結(jié)果顯示高、中劑量蟾毒噻嚀組小鼠腹水抑制率接近或高于5-FU組,蟾毒噻嚀各劑量組和5-FU組瘤細(xì)胞存活率均低于陰性對(duì)照組,且小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)。病理切片的改變反映了腫瘤細(xì)胞在肝臟組織內(nèi)的轉(zhuǎn)移[7]、擴(kuò)散和侵襲。該研究結(jié)果顯示蟾毒噻嚀各劑量組和5-FU組的病理切片與正常肝臟接近,其原因可能與腹腔內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制有關(guān)。
綜上所述,蟾毒噻嚀在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對(duì)HepG2、A549、ECa109 細(xì)胞均表現(xiàn)出抑制作用,可能與其促凋亡和周期阻滯作用有關(guān);在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可抑制S180 腹水瘤細(xì)胞生長(zhǎng),從而減少腹水形成,延長(zhǎng)荷瘤鼠生存時(shí)間,對(duì)腹水引起的腹腔轉(zhuǎn)移癌有治療作用。
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