嗜線蟲致病桿菌HB310 幾丁質(zhì)酶基因chi70 的克隆和表達(dá)

王永娟，張 杰，南宮自艷，宋 萍，白向賓，王勤英

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，保定 071000)

幾丁質(zhì)酶是一類可以降解幾丁質(zhì)的糖苷酶，存在于細(xì)菌、真菌、昆蟲、甲殼綱動(dòng)物以及高等動(dòng)植物體內(nèi)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，幾丁質(zhì)酶可以降解昆蟲體內(nèi)圍食膜中的幾丁質(zhì)，破壞昆蟲保護(hù)屏障，從而為其他昆蟲病原生物侵入到昆蟲體內(nèi)提供便利，提高昆蟲感染率和死亡率，研究表明，幾丁質(zhì)酶可以作為增效因子增強(qiáng)Bt 的毒力(Arora et al.2003)。幾丁質(zhì)酶也可抑制真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長，從鏈霉菌中分離到的幾丁質(zhì)酶能抑制曲霉菌絲的生長(Frank et al.，2005);從熒光假單胞菌中分離的幾丁質(zhì)酶對(duì)棉花枯萎病菌有抑制作用(Naosekpam et al.，2006)。Chen 等從昆蟲病原線蟲共生菌Xenorhabdus 和Photorhabdus 分離出高活性的幾丁質(zhì)酶，并對(duì)其進(jìn)行酶活和抑菌實(shí)驗(yàn)研究(Chen et al.，1996)，認(rèn)為幾丁質(zhì)酶普遍存在于昆蟲病原線蟲共生菌內(nèi)，但有關(guān)共生菌幾丁質(zhì)酶的作用機(jī)制研究報(bào)道卻并不多。

嗜線蟲致病桿菌X.nematophila HB310(Xn HB310)菌株是本實(shí)驗(yàn)室從小卷蛾斯氏線蟲Steinernema carpocaposae HB310 中分離到的共生菌，對(duì)多種包括鱗翅目、鞘翅目在內(nèi)的農(nóng)林害蟲表現(xiàn)出很強(qiáng)的殺蟲活性(李秀花等，2003)，具有巨大的開發(fā)應(yīng)用前景。王勤英等從Xn HB310 分離得到多種具有血腔注射活性和胃毒活性的殺蟲蛋白，并對(duì)這些蛋白的殺蟲機(jī)理進(jìn)行了研究(王勤英等，2005;Wang et al.，2012)。本研究通過克隆和表達(dá)嗜線蟲致病桿菌Xn HB310 幾丁質(zhì)酶基因chi70，對(duì)蛋白Chi70 進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步研究Xn HB310 殺蟲機(jī)制和擴(kuò)大應(yīng)用范圍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和試蟲

嗜線蟲致病桿菌Xn HB310、pET-28a 為本實(shí)驗(yàn)室保存，菌株Escherichia coli DH5α 和E.coli Transetta(DE3)購自于北京全式金公司，pMD18-T 購自于TAKARA 公司。棉鈴蟲Helicoverpa armigera 取自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)蟲室。

1.2 主要試劑

PCR 相關(guān)試劑、Marker 等購自于北京全式金公司，限制性核酸內(nèi)切酶購自于TAKARA 公司，DNA 膠回收試劑盒購自于上海生工。

1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基:牛肉蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，定容1 L，pH7.2-7.4。

NBTA 培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂45 g，氯化三苯基四氮唑(TTC)0.025 g，溴百里酚藍(lán)(BTB)0.04 g，定容到1 L，pH7.2-7.4。

牛肉湯培養(yǎng)基:牛肉蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，定容1 L，pH7.2-7.4。

1.4 膠體幾丁質(zhì)

2 g 粉末幾丁質(zhì)加入40 mL 濃鹽酸，攪拌至完全溶解，800 mL 50%乙醇沉淀過夜，離心，用大量的去離子水洗滌致中性，最后定容到200 mL，制成1%膠體幾丁質(zhì)。

1.5 細(xì)菌總DNA 的提取

將保存于NBTA 平板的Xn HB310 菌落接入到牛肉湯培養(yǎng)基中，180 rpm、28℃震蕩培養(yǎng)24 h，其菌液用于提取細(xì)胞總DNA，提取方法參照(Sanbrook et al.，2003)。

1.6 幾丁質(zhì)酶基因chi70 克隆及原核表達(dá)體系的構(gòu)建

根據(jù)NCBI 已知序列及功能預(yù)測分析設(shè)計(jì)基因chi70 克隆引物，上游引物 C70F:5'-ATGTCTCAAAATGTTTATCGATAC-3'，下游引物C70R:5'-CTACGATTTACGACGGGTTAC-3'。進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，條件為:94℃預(yù)變性10 min;94℃30 s，56℃40 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接后，轉(zhuǎn)入E.coli DH5α。PCR 檢測正確后進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果，重新設(shè)計(jì)表達(dá)引物進(jìn)行PCR，上游引物chi70F:5'-CGCGGATCCATGTCTCAAAATGT TTATCGATA-3'(BamHⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物chi70R:5'-CCCAAGCTTCTACGATTTACGACG GGTTAC(Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))。PCR 產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切處理后插入到相同酶切處理的pET-28a 載體，轉(zhuǎn)入到DH5α，構(gòu)建出表達(dá)載體pET-28a-chi70。通過測序?qū)Σ迦氲腸hi70基因進(jìn)行檢測。

1.7 幾丁質(zhì)酶基因chi70 的分子生物信息學(xué)分析

利用 ExPASy Translate tool 在線程序和DNAMAN 等軟件對(duì)該基因進(jìn)行分子生物學(xué)分析。

1.8 幾丁質(zhì)酶的原核表達(dá)及誘導(dǎo)條件優(yōu)化

將構(gòu)建好的表達(dá)載體pET-28a-chi70 轉(zhuǎn)入到E.coli Transetta(DE3)中，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR 驗(yàn)證后接入到5 mL 含有50 μg/mL 卡那霉素和氯霉素的LB 培養(yǎng)基中，37℃、180 rpm 培養(yǎng)過夜，次日按照1%接種量接入到200 mL 含有相同抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃、180 rpm 培養(yǎng)至OD600為0.5，加入100 mmol/L IPTG 繼續(xù)在37℃震蕩培養(yǎng)。通過設(shè)置不同誘導(dǎo)溫度對(duì)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)條件的優(yōu)化。以相同處理的空載體轉(zhuǎn)化子E.coli Transetta(pET-28a)為對(duì)照。將誘導(dǎo)的菌液離心，10 mL PBS 懸浮，超聲破碎(工作2 s，間隔5 s，共15 min)，4℃、10000 rpm 離心15 min，上清經(jīng)0.22 μm 細(xì)菌過濾器得到誘導(dǎo)表達(dá)的粗蛋白液，SDS-PAGE 電泳檢測，蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法(郭堯君，2001)。

1.9 幾丁質(zhì)酶活性測定

采用二硝基水楊酸法(DNS 法)檢測幾丁質(zhì)酶活性(李華等，2003)。設(shè)置不同pH 值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0)的緩沖液，求出反應(yīng)體系中影響幾丁質(zhì)酶活力的最適pH 值。

1.10 幾丁質(zhì)酶增效作用的測定

將Bt HD-73 菌株懸液濃度設(shè)定為400、200、20、10、2 和1 μg/mL，分別與等體積的無菌水、含有0.3 g/mL 幾丁質(zhì)酶粗提液加入到24 孔板中，每孔分別接入1 頭棉鈴蟲2 齡幼蟲。CK 組分別為滅菌水、Chi70 誘導(dǎo)菌液和Chi70 未誘導(dǎo)菌液的粗提液。每個(gè)處理48 頭試蟲，試蟲在26±1℃、相對(duì)濕度60%、光周期L∶D 為14∶10 條件下飼養(yǎng)72 h，計(jì)算LC50。計(jì)算方法參照張志祥(張志祥等，2002)。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)酶基因的克隆和生物信息學(xué)分析

以chi70 全長引物從嗜線蟲致病桿菌Xn HB310 總DNA 中PCR 擴(kuò)增出了約1900 bp 條帶，測序結(jié)果表明chi70 全長基因?yàn)楹?947bp 的完整開放閱讀框，編碼648個(gè)氨基酸(見圖1)，推導(dǎo)的Chi70 蛋白理論分子量為72.4 kDa，等電點(diǎn)4.89，為酸性蛋白，GC 含量48.8%。將該基因序列提交GenBank 登記，登錄號(hào)為KC701471。

利用ExPASy ProtParam 在線工具對(duì)Chi70 蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Chi70 由10017個(gè)原子組成，分子式為C3231H4903N869O998S16。Chi70 水溶液在280 nm 處的消光系數(shù)為118150，不穩(wěn)定指數(shù)為38.06，半壽期大于10 h(參照大腸桿菌體內(nèi)值)，由此可認(rèn)為該蛋白在細(xì)菌胞內(nèi)可穩(wěn)定存在。Chi70的脂溶指數(shù)(aliphatic index)為71.10，疏水性平均值(GRAVY)為-0.553。利用Protscale 程序?qū)hi70 蛋白進(jìn)行疏水性圖譜分析，其大部分氨基酸屬于親水性，由此表明該蛋白為水溶性蛋白。利用SignalP4.0 對(duì)Chi70 蛋白序列信號(hào)肽的預(yù)測結(jié)果顯示，Chi70 不含信號(hào)肽。

將Chi70 氨基酸序列與GenBank 中登錄的序列進(jìn)行比對(duì)，從中選擇3個(gè)共生菌不同菌株幾丁質(zhì)酶氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果見圖2。從圖中可以看出，Xn HB310 的Chi70 蛋白與不同屬的共生菌P.asymbiotica 幾丁質(zhì)酶同源性并不高，這可能是由于它們的起源不同，但進(jìn)化過程屬于趨同進(jìn)化(Chaston et al.，2013);與同種的X.nematophila ATCC19061 的同源性很高;而同屬不同種的X.bovienii 的序列差異性也很高，說明幾丁質(zhì)酶在進(jìn)化上并不保守，正是因?yàn)檫@種變異，共生菌不同菌株在降解幾丁質(zhì)活性上表現(xiàn)出明顯差異。

2.2 幾丁質(zhì)酶的原核表達(dá)及重組蛋白SDS-PAGE分析

將重組表達(dá)載體pET-28a-chi70 轉(zhuǎn)入到Transetta(DE3)后，加入終濃度為1 μmol/L 的IPTG 在37℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE 電泳檢測。結(jié)果表明，未誘導(dǎo)的菌株沒有表達(dá)目的蛋白，而誘導(dǎo)的菌株隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，目的蛋白表達(dá)量增加，在80 kD 左右處可以看見明顯的誘導(dǎo)蛋白(見圖3)。Chi70 幾丁質(zhì)酶蛋白理論值為72.4 kDa，帶有兩個(gè)HIS 標(biāo)簽共6 kDa，共78 kDa，說明表達(dá)菌株正確地表達(dá)了目的蛋白。目的蛋白以包涵體的形式存在，通過改變誘導(dǎo)溫度使之大量表達(dá)出可溶性目的蛋白，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28℃時(shí)，大量誘導(dǎo)出可溶性融合蛋白。

2.3 幾丁質(zhì)酶酶活測定

以NAG 為反應(yīng)底物，設(shè)置不同梯度濃度，測定OD540值，以確定NAG 濃度與吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為Y=9.8313X-0.0344(R2=0.9905)(其中Y 代表吸光度，X 代表底物濃度)。pH 值對(duì)Chi 酶活的影響見圖4，可以看出，重組Chi70 幾丁質(zhì)酶活性在pH 值為7.0 時(shí)最高，為8.815 U/mL，表明該幾丁質(zhì)酶在中性條件下具有相對(duì)較高的酶解活性。

2.4 幾丁質(zhì)酶的增效作用

分別測定Bt HD-73 菌懸液和HD-73+Chi70混合物對(duì)棉鈴蟲二齡幼蟲的LC50。結(jié)果見表1。從表1 中可以看出，單獨(dú)用HD-73 飼喂棉鈴蟲時(shí)的致死中濃度LC50為14.80 μg/mL;與Chi70 幾丁質(zhì)酶混合后飼喂棉鈴蟲幼蟲時(shí)的致死中濃度LC50則為5.66 μg/mL，后者顯著低于前者，即重組幾丁質(zhì)酶Chi70 對(duì)Bt HD-73 具有增效作用。

圖1 chi70 基因推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Deduced amino acid sequence of gene chi70

圖2 Chi70 蛋白氨基酸與其他3種幾丁質(zhì)酶序列同源比對(duì)Fig.2 Alignment of the amino acid sequence of Chi70 with those of three other homologous species

圖3 chi70 基因表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed product of chi70 gene

圖4 Chi70 幾丁質(zhì)酶在不同pH 值條件下酶活Fig.4 Chi70 chitinase enzyme activity at different pH value

表1 Chi70 幾丁質(zhì)酶對(duì)Bt HD-73 增效作用Table 1 The synergistic activity of chitinase Chi70 to Bt HD-73

3 結(jié)論與討論

Morgan(2001)等發(fā)現(xiàn)，在嗜線蟲致病桿菌X.nematophilus PMFI296 毒素基因xptA1 上游有一個(gè)編碼幾丁質(zhì)酶的基因序列，該基因同樣編碼648個(gè)氨基酸;推斷該幾丁質(zhì)酶基因與其他毒素基因形成一個(gè)共同的致病基因簇，相互協(xié)同，共同對(duì)昆蟲產(chǎn)生致病作用，但具體分子致病機(jī)制還需進(jìn)一步研究。Chen(1996)等針對(duì)5種嗜線蟲致病桿菌屬和發(fā)光桿菌屬線蟲共生菌幾丁質(zhì)酶進(jìn)行研究認(rèn)為幾丁質(zhì)酶普遍存在于昆蟲病原線蟲共生菌中，但活性存在明顯差異，幾丁質(zhì)酶活性的差異與其來源的菌株及測定方法有一定關(guān)聯(lián)。

為了深入研究昆蟲病原線蟲共生菌中幾丁質(zhì)酶的特性，本研究對(duì)嗜線蟲致病桿菌HB310 菌株中的幾丁質(zhì)酶基因chi70 進(jìn)行了克隆、表達(dá)和分子生物信息學(xué)分析，分析結(jié)果表明chi70 基因全長1947 bp，編碼648個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)Chi70 蛋白不含信號(hào)肽，但由于蛋白分泌機(jī)制具有多樣性，這并不能證明它就是一種胞內(nèi)酶，還需要其他方法進(jìn)行進(jìn)一步研究證實(shí)。

昆蟲體壁、圍食膜對(duì)環(huán)境及外界生物的侵害起物理和化學(xué)屏障作用，而其中起主要作用的組分是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)成為害蟲防治的突破點(diǎn)之一(Wiwat et al.，2000)。大量研究表明，幾丁質(zhì)酶與Bt 制劑混合使用可以提高 Bt 殺蟲效果(Smirnoff，1971;Regev et al.，1996;Wiwat et al.，2000)。幾丁質(zhì)酶的來源非常廣泛，Gopakakrishnan等(1995)把煙草天蛾幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入到苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcMNPV 中，并成功表達(dá)了該酶;王芳表達(dá)了桿狀病毒HaSNPV 幾丁質(zhì)酶基因并研究了表達(dá)蛋白對(duì)Bt 的增效作用(2004);丁學(xué)知等將煙草幾丁質(zhì)酶基因和蘇云金芽胞桿菌cry1Ac 進(jìn)行了雙價(jià)基因的表達(dá)，這些研究都表明來源于不同物種的幾丁質(zhì)酶都可以增強(qiáng)Bt 的殺蟲效果。本研究結(jié)果也顯示來自嗜線蟲致病桿菌HB310 菌株的幾丁質(zhì)酶基因重組表達(dá)的Chi70 蛋白對(duì)Bt HD-73 具有明顯的增效作用。

嗜線蟲致病桿菌中的幾丁質(zhì)酶在致病過程中起什么作用尚不清楚，Morgan 等認(rèn)為，幾丁質(zhì)酶基因與其他致病基因形成一個(gè)基因簇，多種表達(dá)產(chǎn)物共同作用造成昆蟲患病死亡。本研究對(duì)共生菌幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行分析，初步了解其理化性質(zhì);通過原核表達(dá)體系對(duì)幾丁質(zhì)酶進(jìn)行研究;并通過生測實(shí)驗(yàn)確定其增效作，為進(jìn)一步研究幾丁質(zhì)酶Chi70 奠定基礎(chǔ)，為下一步深入了解共生菌的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

References)

Arora N，Ahmad T，Rajagopal R，et al.A constitutively expressed 36 ku exochitinase from Bacillus thuringiensis HD-1［J］.Biochem.Biophysi.Res.Communi.，2003，307:620-625.

Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，et al.Short Protocols in Molecular Biology［M］.Wiley，2002.

Chen G，Zhang Y，Li J，et al.Chitinase activity of Xneorhabdus and Photorhabdus species，bacterial associates of Entomopathogenic nematodes［J］.Journal of Invertebrate Pathology，1996，68，101-108(1996).

Chaston JM，Suen G，Sarah LT，et al.The entomopathogenic bacterial endosymbionts Xenorhabdus and photorhabdus convergent lifestyles from divergent genomes［J］.PloS ONE，2011，6(1):e27909.

Frank H，Jessica E，Schmitz，et al.Enrichment of chitinolytic microorganisms:isolation and characterization of a chitinase exhibiting antifungal activity against phytopathogenic fungi from a novel Streptomyces strain［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2005，66(4):4 34-42.

Gopalakrishnan B，Muthukrishnan S，Kramer KG.Baculovirus-mediated expression of a Manduca sexta chitinase gene:Properties of the recombinant protein［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，1995，25(2):255-265.

Guo YJ，Experimental Technique of Protein Electrophoresis［M］.Beijing:Science Press.2001，54-157［郭堯君，蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù).北京:科學(xué)出版社.2001，54-157］

Li H，Liu KQ，Wang G.Measuring the chitinase activity of Trichoderma spp.by oxidation-reduction process［J］.Journal of Zhongkai Agrotechnical College，2003，16(1):19-22.［李華，劉開啟，王革.利用還原糖法測定木霉菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶特性［J］.仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)［J］.2003，16(1):19-22］

Li XH，Wang QY，Lu XJ，et al.Susceptivty of different host insects to symbiotic bacteria of entomopathogenic nematodes［J］.Entomological Knowledge，2004，40(1):39-42［李秀花，王勤英，陸秀君，等.不同昆蟲寄主對(duì)昆蟲病原線蟲共生菌的敏感性比較［J］.昆蟲知識(shí)，2004，40(1):39-42］

Liu YZ，Luo CP，Liu YF，et al.Cloning and expression of a chitinase gene from Serratia marcescens strain C8-8［J］.Agricultural Biotechnology，2014，2(3):56-59.

Morgan JAW，Sergeant M，Ellis D，et al.Sequence analysis of insecticidal genes from Xenorhabdus nematophilus PMFI296［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67(5):2062-2069.

Naosekpam S，Rajni V，Shanmugam V.Extracellular chitinases of fluorescent pseudomonads antifungal to Fusarium oxysporum f.sp.Dianthi causing carnation wilt［J］.Curr.Microbiol.，2006，52:310-316.

Regev A，Keller M，Strizhov N，et al.Synergistic activity of a Bacillus thuringiensis δ-endotoxin and a bacterial endochitinase against Spodoptera littoralis larvae［J］.Appl.Envir.Microbiol，1996，62(10):3581-3586.

Sanbrook J，Russell DW.(Translated by Huang PT).Molecular Cloning(3rdEdition)［M］.Beijing:Science Press，2003.［Sanbrook J，Russell DW.(黃培堂譯).分子克隆(第三版)［M］.北京:科學(xué)出版社，2003］

Smirnoff WA.Effect of chitinase on the action of Bacillus thuringiensis［J］.Can.Entomologist，1971，103:1829-1831.

Wang F，Gu QW，Wu JC，et al.Expression of HaSNPV chitinase gene in E.coli and insect cells and synergism of expressed products with Bt in killing insects［J］.Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2004 20(6):792～797

Wang QY，Nangong ZY，Lu XJ，et al.Purification of insecticidal proteins from Xenorhabdus nematophila HB310 and detection of their insecticidal activity［J］.Acta Entomologica Sinica，2005，48(3):353-358［王勤英，南宮自艷，陸秀君，等.嗜線蟲致病桿菌HB310 菌株殺蟲蛋白的純化及活性鑒定［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2005，48(3):353-358］

Wang QY，Nangong ZY，Yang J，et al.Toxic activity of a protein complex purified from Xenorhabdus nematophila HB310 to Plutella xylostellalarvae［J］.Insect Science，2012，19:329-336.

Wiwat C，Thaithanun S，Pantuwatana S，et al.Toxicity of chitinase-producing Bacillus thuringiensis ssp.HD-1 toward Plutella xylostella［J］.Invertebr.Pathol.，2000，76(4):270-277.

Zhang W，Ni L，Chen LY，et al，Optimizing conditions of chitinase production from Paecilomyces lilacinus strain FZ20289［J］.Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Edition)，2006，34(2):195-199.［張雯，倪莉，程麗云，等.淡紫擬青霉FZ2 0289 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的條件優(yōu)化［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，34(2):195-199］

Zhang ZX，Xu HH，Cheng MD.Calculating toxicity regression with EXCEL［J］.Entomological Knowledge，2002，39(1):67-70［張志祥，徐漢虹，程?hào)|美.EXCEL 在毒力回歸計(jì)算中的應(yīng)用［J］.昆蟲知識(shí)，2002，39(1):67-70］