絲膠對(duì)糖尿病大鼠腎臟轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)的影響

張 艷 李 劍 陳 程 宋成軍 陳志宏 (承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 067000)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)在腎臟表達(dá)最為豐富，而腎臟也是其作用的主要靶器官，多種因素可通過TGF-β1介導(dǎo)導(dǎo)致腎小球或是腎間質(zhì)的損傷〔1〕。糖尿病時(shí)，高血糖、糖基化終末產(chǎn)物、蛋白激酶C、脂代謝紊亂和血管緊張素Ⅱ等多種因素均可激活TGF-β1，導(dǎo)致腎臟TGF-β1的表達(dá)水平升高，從而參與糖尿病腎臟損傷的發(fā)生發(fā)展〔2～4〕。本研究通過觀察糖尿病模型大鼠腎臟TGF-β1表達(dá)的變化，探討蠶繭提取物——絲膠保護(hù)糖尿病腎臟損傷的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用試劑和藥品 絲膠(承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所)，經(jīng)浸泡、水煎、濃縮獲得。鏈脲佐菌素(STZ)美國(guó)Sigma公司，臨用時(shí)用pH 4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成2%的溶液;血糖檢測(cè)試劑盒，保定長(zhǎng)城臨床試劑有限公司;尿素氮、肌酐檢測(cè)試劑盒，北京首醫(yī)臨床科技中心;兔抗TGF-β1多克隆抗體，美國(guó)Santa公司;SP免疫組化試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇、分組、處理 48只3月齡清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體重200～250 g(合格證號(hào):712024)，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)選取其中的12只作為正常對(duì)照組，常規(guī)飼養(yǎng)，腹腔注射同等劑量STZ溶劑(pH4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)3次(1次/d);其余的36只大鼠小劑量STZ連續(xù)腹腔注射(2%STZ，25 mg/kg，3 d)，7 d后檢測(cè)空腹血糖，以≥16.7 mmol/L作為2型糖尿病動(dòng)物模型成功的標(biāo)準(zhǔn)〔5〕;然后再隨機(jī)分為糖尿病模型組、絲膠治療組和陽性對(duì)照組(n=12)，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃 35 d，陽性對(duì)照組給予二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)灌胃35 d，正常對(duì)照組、模型組大鼠灌胃給予同等劑量的生理鹽水35 d。

1.3 檢測(cè)血液指標(biāo) 各組大鼠用藥結(jié)束后禁食12 h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)內(nèi)眥取血后3 000 r/min離心20 min，收集血清-20℃保存。使用日本日立公司的Boehr inger Mannhe in/Hitachi 717全自動(dòng)臨床生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖、谷氨酸脫氫酶兩點(diǎn)法檢測(cè)尿素氮、酶法檢測(cè)肌酐。

1.4 腎臟TGF-β1表達(dá)的檢測(cè)及定量分析 大鼠取血后斷頭處死，取腎臟入Bouins固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚5 μm。SP免疫組化法檢測(cè)腎臟TGF-β1蛋白的表達(dá):TGF-β1一抗1∶100稀釋，4℃過夜，二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染;以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，TGF-β1陽性產(chǎn)物位于細(xì)胞質(zhì)。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析:在高倍鏡下(10×40)選取腎小球，計(jì)算陽性產(chǎn)物面積占腎小球面積的比值;每只大鼠選取3張切片，每張切片選擇3個(gè)腎小球，取平均值作為TGF-β1的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，行單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的血糖、尿素氮和肌酐 糖尿病模型組大鼠的血糖、尿素氮和肌酐明顯高于正常對(duì)照組大鼠(P＜0.01);絲膠治療組、陽性對(duì)照組大鼠的血糖、尿素氮和肌酐明顯低于糖尿病模型組大鼠(P＜0.01，P＜0.05)，且絲膠治療組與陽性對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血液指標(biāo)和腎臟TGF-β1的表達(dá)(s，n=12)

表1 各組大鼠血液指標(biāo)和腎臟TGF-β1的表達(dá)(s，n=12)

與糖尿病模型組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

組別 血糖(mmol/L)尿素氮(mmol/L)肌酐(μmol/L)腎臟TGF-β1正常對(duì)照組 10.83±2.031)5.33±1.031)20.75±3.651)0.065±0.0091)糖尿病模型組 29.45±4.82 11.13±2.70 38.17±8.77 0.104±0.016絲膠治療組 13.20±4.091)7.51±2.421)28.11±2.801)0.071±0.0111)陽性對(duì)照組 13.18±2.301)8.71±2.232)32.03±6.312)0.074±0.0101)

2.2 各組大鼠腎臟TGF-β1蛋白的表達(dá) TGF-β1蛋白免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)膩顆粒狀，位于腎小囊壁層上皮細(xì)胞、足細(xì)胞和球內(nèi)系膜細(xì)胞的胞質(zhì)。與正常對(duì)照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠腎臟TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.01);絲膠治療組、陽性對(duì)照組大鼠腎臟TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯低于糖尿病模型組大鼠(P＜0.01)，且絲膠治療組與陽性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟TGF-β1蛋白的表達(dá)(DAB，×400)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型大鼠的腎功能明顯下降，腎臟TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯升高。TGF-β1的表達(dá)水平升高主要通過增加細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生和促進(jìn)腎臟肥大參與糖尿病腎臟損傷的病理過程:①促進(jìn)腎臟肥大:TGF-β1可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑的表達(dá)和活性，阻止細(xì)胞從G1期過渡到S期，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)和RNA合成增多，從而促進(jìn)腎臟肥大〔6〕。②促進(jìn)ECM積聚:TGF-β1可直接促進(jìn)ECM成分增加，如膠原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ及纖維連接蛋白等〔7〕;TGF-β1還可以抑制膠原酶的合成，阻止參與ECM降解的金屬蛋白酶的合成，以及通過增加激活劑蛋白-1(AP-1)的分泌、抑制纖溶酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)ECM 的降解，促進(jìn) ECM 聚集〔8，9〕。

當(dāng)前治療糖尿病的方法有藥物治療、注射胰島素、細(xì)胞移植和基因治療等，但以藥物治療為主。目前，國(guó)內(nèi)外用于糖尿病治療的藥物有以下幾種:磺脲類、雙胍類、α-糖苷酶抑制劑類、胰島素增敏劑類等，各類藥物雖能較好地控制血糖，延緩病情惡化及并發(fā)癥的發(fā)生，但大多藥物均有不同程度的副作用，大多無法改善胰島素抵抗及有效保護(hù)胰島細(xì)胞，且長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生不良反應(yīng)及耐藥性〔10，11〕。正是西藥的毒副作用促使我們尋找一種降糖療效可靠且毒副作用無或極少的治療糖尿病的中成藥，因此我們選擇了絲膠。

糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴癥”的范疇，治療原則是生精清熱、潤(rùn)燥養(yǎng)陰。蠶繭是蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的繭殼，性甘、溫，無毒，可滋陰潤(rùn)燥、生精止渴，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消，我國(guó)民間早有蠶繭泡水控制血糖的驗(yàn)方。我國(guó)應(yīng)用蠶絲有幾千年的歷史，但主要是將絲素用作衣料，約占繭絲30%的絲膠一直作為廢料丟棄;為了有效利用如此大量?jī)?yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，學(xué)者們開發(fā)了絲膠許多新的功效，如美容、護(hù)膚、營(yíng)養(yǎng)、抗氧化、抗癌等〔12，13〕。但關(guān)于絲膠治療糖尿病及其并發(fā)癥的研究，僅有本課題組進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)絲膠可改善糖尿病時(shí)血脂代謝紊亂、減少胰島細(xì)胞凋亡及減輕糖尿病時(shí)生殖功能障礙〔14～16〕。本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠可明顯降低糖尿病模型大鼠腎臟TGF-β1蛋白的表達(dá);本研究表明，絲膠可通過下調(diào)腎臟TGF-β1蛋白的表達(dá)，抑制 TGF-β1促進(jìn)腎臟肥大的作用及減輕腎臟ECM積聚，從而減輕腎臟肥大和ECM進(jìn)行性加重導(dǎo)致的腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化，因此絲膠可有效保護(hù)糖尿病時(shí)的腎臟損傷，并且由于絲膠是天然的蛋白質(zhì)，可避免化學(xué)合成藥物帶來的毒副作用。但絲膠是否可通過其他途徑保護(hù)糖尿病腎臟損傷，有待于進(jìn)一步的深入研究。

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