鹽酸氨溴索緩釋混懸劑在犬體內(nèi)的生物等效性研究

尹飛，劉宏飛，師雙雙，潘衛(wèi)三（1.遼寧省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽(yáng)110042；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng)110016；.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 21201）

鹽酸氨溴索（Ambroxol hydrochloride，AH）作為呼吸系統(tǒng)祛痰藥的首選藥物已被廣泛研究，并已有多種劑型上市。但尚未有AH液體緩釋制劑的研究，如能將其制備成液體緩釋制劑，將會(huì)增加其適用人群（嬰幼兒、老年患者），提高患者服用的順應(yīng)性（易于服用、便于分劑量等）[1-2]。筆者自制了AH緩釋混懸劑，采用高效液相色譜（HPLC）法作為檢測(cè)方法，對(duì)AH緩釋混懸劑在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征及與市售AH緩釋膠囊的生物等效性進(jìn)行了研究，為其臨床研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HPLC儀，包括LC-10A型輸液泵、SPD-10A型紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；TG328B電光分析天平（上海天平儀器廠）；MD200-2電光分析天平[奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

AH對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100599-201203，純度：99.9%）；受試制劑：AH緩釋混懸劑（沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院自制，批號(hào)：20120601，規(guī)格：75 mg∶10 ml）；參比制劑：AH緩釋膠囊（常州第四制藥廠，批號(hào)：H20124211，規(guī)格：每粒75 mg）；內(nèi)標(biāo)鹽酸丁咯地爾（原料藥，齊魯制藥有限公司，批號(hào)：20120326，純度：99.94%）；氫氧化鈉、乙醚、鹽酸均為分析純，乙腈和甲醇均為色譜純，水為純化水。

1.3 動(dòng)物

健康Beagle犬6條，♀♂各半，體質(zhì)量12～15 kg，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，使用許可證號(hào)：SYXK（遼）2003-0012。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用兩制劑雙周期試驗(yàn)設(shè)計(jì)。取犬6只，禁食12 h后分別灌服參比制劑或受試制劑75 mg，自由飲水，給藥4 h后統(tǒng)一進(jìn)食，間隔時(shí)間為1周。在犬前肢靜脈處安置留置針，于給藥前取空白血，給藥后1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、24 h取樣品血5 ml，肝素抗凝，立即3000 r/min（離心半徑13.5 cm，下同）離心10 min，分離出血漿，于－20℃下保存，待分析。

2.2 血漿樣品的處理[3-6]

取犬血漿1 ml，置于10 ml具塞玻璃試管中，加入50 μl內(nèi)標(biāo)水溶液（鹽酸丁咯地爾10 μg/ml），旋渦混勻30 s，加入0.01 mol/L的氫氧化鈉溶液0.5 ml，渦旋混勻30 s，加入乙醚5 ml，封口后旋渦混勻3 min，4000 r/min離心8 min；分取醚層4 ml至另一支10 ml具塞玻璃試管中，再加入0.03 mol/L的鹽酸溶液200 μl，渦旋混勻3 min，4000 r/min離心8 min；棄去醚層；取酸層20 μl注入HPLC儀進(jìn)行分析。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 5.3）-三乙胺（100∶100∶100∶0.04），流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：307 nm；進(jìn)樣量：20 μl；溫度：35 ℃。分別取空白血漿、空白血漿+AH+內(nèi)標(biāo)、血漿樣品+內(nèi)標(biāo)，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B空白血漿+AH+內(nèi)標(biāo)；C.血漿樣品+內(nèi)標(biāo)；1.AH；2.內(nèi)標(biāo)Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+AH+internal standard；C.plasma sample+internal standard；1.AH；2.internal standard

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取AH對(duì)照品適量，配制成0.5、1、2、5、10、25 μg/ml的對(duì)照品溶液。精密量取空白血漿0.9 ml，置于10 ml具塞玻璃試管中，分別精密加入上述對(duì)照品溶液100 μl制成含AH 0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 μg/ml的血漿樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。以AH與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)、AH的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝1.345x+0.006（r＝0.9995），AH檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.05～2.5 μg/ml。信噪比為3時(shí)，檢測(cè)限為0.12 ng；信噪比為10時(shí)，定量限為0.4 ng。

2.5 方法回收率與提取回收率考察

按“2.4”項(xiàng)下方法制備含AH 0.05、0.5、2.5 μg/ml的血漿樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算質(zhì)量濃度，與樣品質(zhì)量濃度的比值計(jì)算方法回收率；另取質(zhì)量濃度為 0.05、0.5、2.5 μg/ml的AH水溶液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，記錄色譜圖和峰面積，以相應(yīng)質(zhì)量濃度血漿樣品峰面積與AH水溶液峰面積的比值計(jì)算提取回收率，重復(fù)5次。回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1Results of recovery and precision tests（n＝5）

2.6 日內(nèi)精密度與日間精密度考察

精密量取空白血漿0.9 ml，置于10 ml具塞玻璃試管中，分別精密加入100 μl“2.4”項(xiàng)下對(duì)照品溶液制備成的含AH分別為0.05、0.5、2.5 μg/ml的血漿樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算質(zhì)量濃度。同日內(nèi)每一質(zhì)量濃度測(cè)定5次考察日內(nèi)精密度；每日測(cè)1次，連續(xù)測(cè)定5 d考察日間精密度，結(jié)果見表1。

2.7 藥動(dòng)學(xué)研究

2.7.1 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。取“2.1”項(xiàng)下各犬的血漿，按“2.2”項(xiàng)下方法處理、進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按內(nèi)標(biāo)法代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算質(zhì)量濃度，繪制兩種制劑在犬體內(nèi)的藥-時(shí)曲線，見圖2。

圖2 兩種制劑在犬體內(nèi)的藥-時(shí)曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of 2 kinds of preparations in Beagle dogs

由于參比制劑與受試制劑均為緩釋制劑，不能直接由3p87程序判斷隔室模型，根據(jù)研究資料確立AH的隔室模型為單室模型[7-9]。采用非隔室模型計(jì)算兩種制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 兩種制劑在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 2 Pharmacokinetic parameters of 2 kinds of preparations in Beagle dog（s±s，n＝6）

表2 兩種制劑在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 2 Pharmacokinetic parameters of 2 kinds of preparations in Beagle dog（s±s，n＝6）

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)t1/2，h tmax，h cmax，μg/ml AUC0-24 h，μg· h/ml AUC0-∞，μg· h/ml MRT，h參比制劑4.48±0.224.33±0.522.06±0.1820.55±1.3821.33±1.378.86±0.21受試制劑4.21±0.155.00±0.001.90±0.2721.70±3.1122.49±3.199.28±0.11

2.7.2 生物等效性與生物利用度判定。對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行雙單側(cè)t檢驗(yàn)，結(jié)果受試制劑的AUC0-24h有90%可信區(qū)間在參比制劑AUC0-24h的96.6%～113.8%內(nèi)；受試制劑的cmax有90%可信區(qū)間在參比制劑cmax的88.9%～106.5%內(nèi)，表明受試制劑與參比制劑有生物等效性。受試制劑針對(duì)參比制劑的相對(duì)生物利用度為105.2%。

2.7.3 體內(nèi)外相關(guān)性。AH口服屬于單室模型，采用W-N法計(jì)算不同時(shí)間的吸收分?jǐn)?shù)（Fa），以體外累積釋放百分率（F）為自變量、體內(nèi)Fa為應(yīng)變量，進(jìn)行最小二乘法線性回歸，求得相關(guān)方程和相關(guān)系數(shù)（r），判定體外釋放與體內(nèi)吸收的相關(guān)性。結(jié)果回歸方程為Fa＝1.7035F－0.1409（r＝0.9121），表明體內(nèi)外相關(guān)性較好。

3 討論

AH于244 nm和307 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，雖然在244 nm波長(zhǎng)處AH靈敏度較高，但血漿雜質(zhì)對(duì)藥物有明顯干擾；而307 nm波長(zhǎng)處雖然藥物靈敏度略有降低，但由于為遠(yuǎn)端吸收，雜質(zhì)峰高降低50倍且對(duì)藥物無干擾。故最終選擇307 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

受試制劑的消除相曲線不如參比制劑平滑，應(yīng)該是由于相對(duì)于參比制劑，受試制劑在腸道反離子的作用下緩慢釋放藥物，故存在部分二次吸收現(xiàn)象。

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