壬基酚聚氧乙烯醚絡合碘消毒液的研制及其效果和安全性評價

黃道望，向紅菊，胡焰，王霞，易利丹，彭六保，李健和#（.桑植縣人民醫(yī)院，湖南桑植4700；.中南大學湘雅二醫(yī)院藥學部，長沙 400；3.中南大學藥學院，長沙 4003）

碘是一種常用的消毒劑，可廣泛用于皮膚、黏膜、器械、物品的消毒。但元素碘存在異臭味、水溶解度小、刺激性大、易升華、易引起黃染和過敏反應等缺點，故將碘與高分子化合物構成絡合碘。根據(jù)載體的不同，其可分為許多種類，其中尤以聚維酮碘和聚醇醚碘應用最廣泛[1-4]。有研究表明，聚維酮碘殺滅細菌繁殖體所需濃度比聚醇醚碘高1倍，殺滅真菌（白色念珠菌）所需濃度比聚醇醚碘高3倍[4]。壬基酚聚氧乙烯醚TX-10為一種非離子表面活性劑，具有良好的乳化性、水溶性和分散性，可與碘絡合生成聚醇醚碘的水溶液，適用于皮膚及創(chuàng)面消毒，可殺滅醫(yī)院感染常見細菌、腸道致病菌、化膿性球菌、致病性酵母菌等[5-6]?；谠氐獾牟蛔阋约叭苫泳垩跻蚁┟呀j合碘的特點，中南大學湘雅二醫(yī)院藥學部研制開發(fā)了壬基酚聚氧乙烯醚絡合碘消毒液，其碘載于表面活性劑所形成的膠粒束中央，在水中可逐漸解聚釋放出游離碘，從而發(fā)揮持久的殺菌作用，應用于臨床醫(yī)療和護理消毒等領域取得了滿意療效?，F(xiàn)將其處方工藝、穩(wěn)定性、有效性及安全性評價結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器

BHC-ⅡA2生物安全柜（阿爾泰實驗室設備北京有限公司）；AE200電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；pHS-3C精密pH計（深圳市三諾電子儀器有限公司）。

1.2 藥品、試劑與培養(yǎng)基

碘（天津市津云制碘廠，批號：20120123，純度：99.6%）；壬基酚聚氧乙烯醚TX-10（深圳泰達化工有限公司，批號：20120214，純度：99.6%）；亞硫酸氫鈉（北京天壇生物制品股份有限公司，批號：20120225，純度：99.8%）；環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)有限公司，批號：20110301，純度：99.7%）；壬基酚聚氧乙烯醚絡合碘消毒液樣品（中南大學湘雅二醫(yī)院藥學部研制，批號：20121008、20121010、20121012，規(guī)格：500 ml/瓶）；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術有限公司，批號：20120425）；沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基（上海信然生物技術有限公司，批號：20120806）。

1.3 細菌

金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、大腸埃希菌（ATCC8099）、銅綠假單胞菌（ATCC15442）、白色念珠菌（ATCC10231）均由軍事醫(yī)學科學院提供。

1.4 動物

健康白色家兔，♂，體質(zhì)量2.0～2.4 kg；SPF級昆明種小鼠，♀♂各半，體質(zhì)量18.0～22.0 g。動物均由長沙東創(chuàng)實驗動物科技服務部提供，使用許可證號：SYXK（湘）2010-0011。

2 方法與結果

2.1 處方工藝

2.1.1 處方。6.5 g碘，50 g壬基酚聚氧乙烯醚TX-10，0.475 g亞硫酸氫鈉，純化水加至1000 ml。

2.1.2 工藝。稱取50 g壬基酚聚氧乙烯醚TX-10加入配料罐中，溫度控制在（40±2）℃，然后將碘6.5 g慢慢加入其中，加完后繼續(xù)攪拌5 h以上，至絡合反應充分完全，加亞硫酸氫鈉0.475 g使溶液澄清，補加純化水至1000 ml，攪勻，取樣測定藥液pH和有效碘含量合格后，灌裝，貼簽，包裝，即得。

2.2 質(zhì)量控制

2.2.1 性狀。本品為黃棕色至紅棕色澄明液體，有碘氣味。經(jīng)檢測批號為20121008、20121010、20121012的樣品均為棕色澄明液體，有碘氣味，均符合規(guī)定。

2.2.2 鑒別。取本品1～5滴，置于試管中，加水10 ml與淀粉指示液1 ml混合后，即顯深藍色。經(jīng)檢測批號為20121008、20121010、20121012的樣品均呈正反應，均符合規(guī)定。

2.2.3 pH。取本品，依法[7]檢查，pH應為2.0～4.0。經(jīng)檢測批號為20121008、20121010、20121012的樣品pH分別為2.52、2.47、2.38，均符合規(guī)定。

2.2.4 裝量。取本品，依法[7]檢查，應符合規(guī)定。經(jīng)檢測批號為20121008、20121010、20121012的樣品裝量均符合規(guī)定。

2.2.5 有效碘含量測定。精密量取本品25 ml，置于100 ml碘量瓶中并加入36%醋酸溶液5滴，用0.1 mol/L硫代硫酸鈉滴定液滴定，邊滴邊搖勻，待溶液呈淡黃色時加入5 g/L淀粉溶液10滴（溶液立即變藍色），繼續(xù)滴定至藍色消失，并將滴定的結果用空白試驗校正。每1 ml硫代硫酸鈉滴定液（0.1 mol/L）相當于12.69 mg的碘。經(jīng)測定批號為20121008、20121010、20121012的樣品中的有效碘含量分別為5276、5210、5195 mg/L，均在有效碘含量范圍（4500～5500 mg/L）之內(nèi)，符合企業(yè)規(guī)定。

2.3 穩(wěn)定性試驗

依據(jù)2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]要求，將批號為20121008的樣品置于37℃溫箱90 d，測定其0 d和90 d時的有效碘含量，考察樣品的穩(wěn)定性。結果0 d和90 d的有效碘平均含量分別為5276 mg/L和5140 mg/L，其有效碘下降率為2.58%，按有效碘下降率不超過10%暫定該產(chǎn)品有效期為2年。

2.4 殺滅微生物效果試驗

2.4.1 菌懸液制備。分別取經(jīng)24 h培養(yǎng)的新鮮斜面培養(yǎng)物金黃色葡萄球菌（第5代）、大腸埃希菌（第6代）、銅綠假單胞菌（第6代）、白色念珠菌（第5代），均先用磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液）或熱塑性淀粉洗下菌苔，混勻。將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌均用含3%的牛血清白蛋白PBS緩沖液進行對倍稀釋，使回收菌落數(shù)均達1×107～5×107CFU/ml；白色念珠菌用含3%的牛血清白蛋白PBS緩沖液進行對倍稀釋，使回收菌落數(shù)達1×106～5×106CFU/ml。

2.4.2 中和劑鑒定試驗。試驗在（20±1）℃溫度下進行。用胰蛋白胨生理鹽水（0.9%氯化鈉注射液）稀釋樣品，使稀釋后含有效碘2641 mg/L（1∶1稀釋液，V/V），將其與其他待試液置（20±1）℃溫度下預溫5 min，再參照2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]中和劑鑒定試驗的分組方法分為6組進行中和效果試驗測定。試驗菌為金黃色葡萄球菌、白色念珠菌，擬選中和劑為含0.3%硫代硫酸鈉、1.0%聚山梨酯80和0.1%卵磷脂的PBS緩沖液，殺菌作用時間為0.5 min，中和作用時間為10 min。金黃色葡萄球菌用胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、白色念珠菌用沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基傾皿計數(shù)，試驗重復3次，結果詳見表1。

表1 中和劑鑒定試驗結果Tab 1 Results of neutralizer identification test

由表1可見，金黃色葡萄球菌第1、2組無菌生長，第3、4、5組平均回收菌落數(shù)組間誤差率[組間誤差率＝（3組間平均回收菌落數(shù)－各組平均回收菌落數(shù)）的絕對值之和/（3組間回收菌落平均數(shù)×3）×100%]為3.14%，第6組無菌生長；將消毒液和中和劑均以1∶9（V/V）稀釋后重做第1、2組試驗，結果第1組無菌生長，第2組平均回收菌落數(shù)為80 CFU/ml（3次結果分別為90、70、80 CFU/ml）。白色念珠菌第1、2組無菌生長，第3、4、5組平均回收菌落數(shù)組間誤差率為3.09%，第6組無菌生長；將消毒液和中和劑均以1∶9（V/V）稀釋后重做第1、2組試驗，結果第1組無菌生長，第2組平均回收菌落數(shù)為73 CFU/ml（3次結果分別為60、70、90 CFU/ml）。表明中和劑可中和殘留的含有效碘為2110 mg/L的樣品（1∶1稀釋液，V/V）對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的殺滅作用，且中和劑及中和產(chǎn)物對試驗菌的生長和培養(yǎng)基均無不良影響。

2.4.3 懸液定量殺菌試驗。試驗在（20±1）℃溫度下進行。取4.0 ml含有效碘2110 mg/L的樣品加入滅菌試管內(nèi)，分別加入1.0 ml的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及白色念珠菌菌懸液，作用0.5、1.5、3.0 min后，將菌藥混懸液取0.5 ml加入4.5 ml中和劑內(nèi)，中和10 min后，分別取樣，其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌用胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，白色念珠菌用沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基傾皿檢驗殘留活菌數(shù)。試驗同時設陽性對照（稀釋液代替樣品）組、陰性對照（樣品）組，試驗重復3次。結果，陰性對照組無菌生長，其他結果詳見表2[表中，殺滅對數(shù)值（KL）＝陽性對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（N0）－陰性對照組活菌濃度對數(shù)值（Nx）]。

表2 消毒液對4種試驗菌的殺滅效果Tab 2 Killing effect of the disinfectant on 4 kinds of test strain

由表2可見，含有效碘2110 mg/L的樣品作用0.5 min對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的KL各次均＞5.00，對白色念珠菌的KL各次均＞4.00。

2.5 皮膚消毒現(xiàn)場試驗

依據(jù)2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]要求，在局部100級空氣潔凈試驗室、溫度21～23℃、濕度60%～65%條件下，將規(guī)格版（5.0 cm×5.0 cm）固定在受試者（已簽署知情同意書）左臂內(nèi)側中段表面，將無菌棉簽在含10 ml 0.1%聚山梨酯80的0.03 mol/L PBS緩沖液的試管（pH 7.2）中浸濕，在規(guī)格版框定的區(qū)域內(nèi)，橫向往返涂擦10遍，縱向往返涂擦3遍；同時用含有效碘2638 mg/L的樣品（1∶1稀釋液，V/V）對右臂內(nèi)側進行消毒，作用1.0 min后，用中和劑代替PBS緩沖液，方法同上采樣。結果本品經(jīng)30人次皮膚消毒現(xiàn)場試驗，其作用1.0 min對皮膚上自然菌的平均最低KL為1.21（＞1.00）。

2.6 急性經(jīng)口毒性實驗

依據(jù)2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]要求，采用一次最大限度試驗，設劑量為5000 mg/kg。實驗條件為屏蔽環(huán)境，溫度22～24℃，濕度50%～56%。實驗時稱取樣品12.50 g，加蒸餾水定容至50 ml，混勻，按0.2 ml/10 g給昆明種小鼠一次性經(jīng)口灌胃，灌胃前禁食16 h，灌胃后連續(xù)觀察14 d，記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。結果灌胃后小鼠無明顯中毒表現(xiàn)，觀察14 d無死亡。實驗末處死全部小鼠進行解剖，肝、腎、脾、胃、腸、心、肺等主要臟器未見肉眼可見的異常改變。在本實驗條件下，樣品對昆明種小鼠的急性經(jīng)口半數(shù)致死量均＞5000 mg/kg。根據(jù)2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]中急性毒性分級標準，本品屬實際無毒級。

2.7 刺激實驗

2.7.1 多次皮膚刺激實驗。依據(jù)2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]要求，在溫度22～24℃、濕度50%～54%條件下，取家兔3只，實驗前24 h將其背部脊柱兩側的毛剪掉，去毛范圍左右各約3 cm×3 cm；次日，將樣品0.5 ml均勻涂抹于一側去毛皮膚表面，另一側去毛皮膚作為空白對照；涂抹4 h后，用蒸餾水清除殘留樣品。每天涂抹1次，連續(xù)涂抹14 d。必要時剪毛，不損傷皮膚。在每次涂抹后24 h觀察結果，按2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]中的規(guī)定進行皮膚刺激反應評分。實驗結束后，計算每天每只家兔的平均積分并進行皮膚刺激強度評價，實驗結果見表3。

表3 多次皮膚刺激實驗結果Tab 3 Results of repeated skin irritation test

根據(jù)表3中的實驗結果以及2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]中的皮膚刺激強度分級標準，在本實驗條件下，本品對家兔的多次皮膚刺激強度屬無刺激性。

2.7.2 一次破損皮膚刺激實驗。依據(jù)2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]要求，在溫度22～23℃、濕度52%～54%條件下，取家兔3只，實驗前24 h，將家兔背部脊柱兩側的毛剪掉，去毛范圍左右各約3 cm×3 cm。次日，在涂樣品前，在去毛皮膚上，用75%乙醇清潔、消毒暴露皮膚，待乙醇揮發(fā)后，用注射針頭在皮區(qū)內(nèi)劃一個“井”形的破損傷口，將0.5 ml樣品滴于2.5 cm×2.5 cm大小的4層紗布上，敷貼在一側破損皮膚表面，然后用一層油紙覆蓋，再用無刺激性膠布固定，作為受試組；另一側去毛破損皮膚用等量生理鹽水作為對照組，同法處理。敷用4 h后，用蒸餾水除去殘留樣品，分別于去除樣品后1、24、48 h，觀察皮膚局部反應，按2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]中的規(guī)定進行刺激反應評分和刺激強度評價。結果1、24、48 h時受試組與對照組紅斑、水腫的評分均為0分，各時間點樣品對家兔的一次破損皮膚刺激反應的最高評分均值為0分。根據(jù)2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]中的皮膚刺激強度分級標準，在本實驗條件下，本品對家兔的一次破損皮膚刺激強度屬無刺激性。

2.7.3 陰道黏膜刺激實驗。依據(jù)2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]要求，溫度22～24℃、濕度50%～54%條件下，取家兔6只，分為染毒組和對照組，每組3只。將長度為8 cm左右的鈍頭軟管與2 ml注射器連接，注滿樣品備用。每只家兔準備一套。將家兔仰面固定，暴露會陰和陰道口，將導管用樣品或生理鹽水濕潤后輕柔地插入陰道（4～5 cm），并用注射器緩慢注入2 ml樣品，抽出導管，完成染毒，為染毒組；對照組家兔用生理鹽水作同法處理。染毒后24 h，采用氣栓法處死家兔，剖腹取出完整的陰道，縱向切開，肉眼觀察是否有充血、水腫等表現(xiàn)。然后將陰道置于10%福爾馬林溶液中固定24 h以上，選取陰道兩端和中央3個部位的組織制片，蘇木精-伊紅（HE）染色后，進行組織病理學檢查，按2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]中的陰道黏膜刺激反應評分標準對刺激反應進行評分。結果在本實驗條件下，肉眼觀察陰道無充血、水腫等異常表現(xiàn)；染毒組和對照組對家兔陰道黏膜刺激反應評分的總評分分別為7分和4分，兩組的平均評分分別為0.78分和0.44分。本品對家兔陰道黏膜刺激實驗的刺激指數(shù)（染毒組平均評分－對照組平均評分）為0.34分，屬無刺激性。

2.7.4 急性眼刺激實驗。依據(jù)2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]要求，在溫度22～23℃、濕度50%～54%條件下，取家兔3只，吸取樣品0.1 ml，滴入家兔左側眼結膜囊內(nèi)，另一側眼以生理鹽水作為對照組。滴樣品后，將眼被動閉合4 s，30 s后用生理鹽水沖洗。于滴眼后1 h和1、2、3、7、14、21 d肉眼觀察家兔眼結膜、虹膜和角膜的損傷與恢復情況。如果3 d內(nèi)未出現(xiàn)刺激反應，或第7天、第14天眼睛刺激反應完全恢復，即可提前終止實驗；必要時，用2%熒光素鈉溶液、放大鏡檢查角膜及虹膜變化。按2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]中急性眼刺激反應的評分標準對家兔角膜、虹膜和結膜的急性刺激反應進行評分，并分別計算每只家兔在3個不同觀察時間（1、2、3 d）的角膜損害、虹膜損害、結膜充血和結膜水腫4個方面的平均評分（即每只家兔的1、2、3 d評分之和除以觀察數(shù)3）。分別以家兔眼角膜、虹膜和結膜充血、水腫的平均評分和恢復時間，按眼刺激反應分級標準判定樣品對眼睛的刺激程度。結果染毒后1 h，染毒組2只家兔眼結膜血管充血呈鮮紅色，眼結膜輕微水腫，角膜、虹膜無損傷；2 d內(nèi)表現(xiàn)完全消失，故觀察7 d終止實驗。對照組在上述3個不同觀察時間均未見角膜與虹膜損害、結膜充血和結膜水腫。在本實驗條件下，樣品對家兔的急性眼刺激實驗的平均評分為：角膜損害0分，虹膜損害0分，結膜充血＜1分，結膜水腫＜1分。根據(jù)2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]的眼刺激強度分級標準，本品屬無刺激性。

2.8 微核實驗

依據(jù)2002年版《消毒技術規(guī)范》[8]要求，在屏蔽環(huán)境、溫度23～24℃、濕度50%～56%條件下，采用經(jīng)口灌胃30 h染毒法進行動物染毒。取SPF級昆明種小鼠50只，按體質(zhì)量隨機分為5組，每組10只，♀♂各半。以40 mg/kg劑量的環(huán)磷酰胺為陽性對照組，蒸餾水為陰性對照組，樣品3個劑量分別為5000、2000、500 mg/kg（高、中、低劑量）組，分別取樣品12.50、5.00、1.25 g加蒸餾水定容至50 ml，間隔24 h給小鼠灌胃2次，每次灌胃0.2 ml/10 g。末次給藥后6 h頸椎脫臼處死小鼠，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光學顯微鏡下，每只小鼠計數(shù)1000個嗜多染紅細胞（PCE），觀察含有微核的PCE數(shù)，計算微核率（以‰計）；每只小鼠計數(shù)200個PCE，計算PCE與成熟紅細胞的比例（PCE/NCE）。采用SPSS 11.0軟件統(tǒng)計分析，實驗結果見表4。

表4 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗結果Tab 4 Results of bone marrow polychromatic erythrocyte micronucleus test in mice

表4中的結果表明，樣品各劑量組含微核率與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，而陽性對照組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在本實驗條件下，小鼠微核實驗結果為陰性，說明本品屬無染色體損傷性。

3 討論

制備聚醇醚碘消毒劑，可選用聚醇醚和磺酸的混合物，其優(yōu)點是用量較少，使用量是碘的5.6倍，其中磺酸占20%?；撬醿r格比較便宜，是聚醇醚的60%，但磺酸需加氫氧化鈉制成鈉鹽，反應過程溫度升高，需要冷卻、降溫，操作比較麻煩，同時質(zhì)量難以控制；磺酸分子中支鏈較多，微生物難以降解，有可能造成環(huán)境污染。而本產(chǎn)品單獨使用聚醇醚作為載體，其用量是碘的7.6倍，雖然用量較多，但操作簡單，減少了磺酸對環(huán)境的污染。本產(chǎn)品處方合理，制備工藝簡單，產(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定，殺菌效果良好，無刺激性。

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