不同粒徑納米和常規(guī)微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織的氧化損傷作用

高艷榮 余艷琴 賈玉巧 高冰 白鋼 郝金奇

(包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，014060)

納米材料(nanomaterial)是應(yīng)用納米技術(shù)制造的具有納米尺度(粒徑在1～100 nm之間)及特殊理化性質(zhì)的物質(zhì)[1]。納米SiO2是我國目前產(chǎn)量最大的納米材料之一，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于塑料工程、生物醫(yī)學(xué)工程、殺菌劑、食品加工等多個領(lǐng)域[2-3]。這就意味著納米SiO2的研究者、生產(chǎn)者、消費者乃至消費品處理者以及其進入環(huán)境后涉及的整個生態(tài)系統(tǒng)接觸它的機會大大增加。有研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)納米顆粒物的毒性都比同質(zhì)量微米級顆粒物要強，納米顆粒物有可能進入機體，并穿過體內(nèi)的生物屏障系統(tǒng)到達(dá)微米顆粒物所不能到達(dá)的區(qū)域，如肺間質(zhì)、循環(huán)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)，甚至細(xì)胞內(nèi)，一些原本無毒或低毒的微米級顆粒材料當(dāng)粒徑達(dá)到納米級時，毒性顯著增強[4-5]。因此，納米SiO2對人體健康和生態(tài)環(huán)境的潛在危害已經(jīng)引起人們極大的關(guān)注。本文研究了不同尺度納米和常規(guī)SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織的氧化損傷作用，試圖探討不同粒徑納米和常規(guī)SiO2對多種組織器官的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級SD大鼠80只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，購于中國食品藥品檢定研究所，動物質(zhì)量合格號SCKK(京)2009-0017，動物購進后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對濕度40%～70%，動物自由飲水、攝食。20 nm SiO2、60 nm SiO2購于Sigma公司，微米SiO2(粒徑為0.1～5μm)購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、TBA、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和染塵 80只大鼠隨機分為10組，每組8只，分別為20 nm SiO2高、中和低劑量組，60 nm SiO2高、中和低劑量組，微米SiO2高、中和低劑量組和陰性對照組。將20 nm SiO2、60 nm SiO2和微米SiO2用生理鹽水分別配成67.5 mg/mL、22.5 mg/mL和7.5 mg/mL高、中、低3個濃度的混懸液，用漩渦攪拌器不斷攪拌，大鼠用0.3%巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，采用非暴露氣管插管式按給大鼠染塵，陰性對照組經(jīng)氣管注入等體積的生理鹽水。染毒48 h后處死大鼠，取出肺、肝、睪丸組織，進行各項指標(biāo)的測定。

1.2.2 指標(biāo)測定 染塵48 h后采用麻醉后腹主動脈放血法處死大鼠，摘取肺、肝、心、睪丸組織，分別稱取0.5 g，加4.5 mL冷生理鹽水，冰水浴下制成10%的勻漿。黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，DTNB直接法測定GSH-Px含量，通過測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)的含量，以表示脂質(zhì)過氧化作用(LPO)水平，組織蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法，操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.3 統(tǒng)計方法 采用Excel建庫，SPSS 13.0軟件統(tǒng)計分析。組間比較采用方差分析(ANOVA)，均數(shù)間多重比較用最小極差法(LSD)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米和常規(guī)微米SiO2對大鼠肺、肝、睪丸組織SOD酶活性的影響(表1)由表1可知，隨著劑量逐漸增加，20 nmSiO2和60 nm SiO2均可引起大鼠肺、肝和睪丸組織SOD酶活性逐漸降低。在67.5 mg/kg劑量下，20 nm SiO2和60 nm SiO2組的肺和肝臟SOD酶活性與陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且20 nm SiO2組大鼠心臟SOD酶活性與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，在22.5 mg/kg劑量下，肺和肝臟SOD酶活性與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與陰性對照組比較，微米SiO2只引起肺組織SOD酶活性降低(P＜0.05)。

表1 納米和常規(guī)微米SiO2對大鼠肺、肝、睪丸組織SOD酶活性的影響(±s，n＝8，U/mgprot)

表1 納米和常規(guī)微米SiO2對大鼠肺、肝、睪丸組織SOD酶活性的影響(±s，n＝8，U/mgprot)

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量(mg/kg) 肺臟 肝 心 睪丸陰性對照組 0 115.23±10.84 147.33±13.51 107.75±10.84 90.74±8.63 20 nm SiO2組 7.5 98.33±18.34 136.17±25.14 117.63±18.34 87.51±11.71 22.5 71.47±12.70* 95.60±13.80* 98.47±15.16 83.60±6.81 67.5 60.36±10.94* 83.67±18.38** 81.73±12.70* 62.59±7.54*60 nm SiO2組 7.5 107.50±10.91 137.49±23.67 108.15±11.74 81.74±10.91 22.5 93.73±9.24* 113.83±14.84* 95.33±15.43 85.34±13.18 67.5 63.61±13.71* 94.73±21.80* 97.06±22.67 70.83±9.57*微米SiO2組 7.5 113.12±17.69 147.38±19.29 104.08±16.67 90.83±17.41 22.5 98.67±12.29* 145.70±20.85 103.5±17.37* 95.61±13.60 67.5 80.91±13.41* 131.84±22.73 97.6±27.4 91.08±10.87

2.2 納米和常規(guī)微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織GSH-Px酶活性的影響(表2) 由表2可知，隨著劑量逐漸增加，20 nm SiO2和60 nm SiO2均可引起大鼠肺、肝和睪丸GSH-Px酶活性逐漸降低。肺、肝臟在67.5 mg/kg劑量下，20 nm SiO2和60 nm SiO2組的GSH-Px酶活性與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在22.5 mg/kg劑量下，20 nm SiO2組的肺、肝組織GSH-Px酶活性也顯著低于對照組(P＜0.05)。各實驗組大鼠心臟GSH-Px酶活性與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。微米SiO2只引起肺組織GSH-Px酶活性降低(P＜0.05)。

表2 納米和常規(guī)微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織GSH-Px酶活性的影響(±s，n＝8，U/mgprot)

表2 納米和常規(guī)微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織GSH-Px酶活性的影響(±s，n＝8，U/mgprot)

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量(mg/kg) 肺臟 肝 心 睪丸陰性對照組 0 51.80±4.63 65.41±5.42 45.53±4.71 38.16±5.74 20 nm SiO2組 7.5 51.50±3.07 58.62±5.69 46.23±4.58 37.43±3.81 22.5 39.18±3.64* 45.73±5.64* 43.65±6.20 34.54±3.58 67.5 32.71±3.07** 41.85±6.48* 31.82±3.77* 27.52±3.40*60 nm SiO2組 7.5 47.33±4.80 62.73±4.75 40.83±4.90 38.61±4.18 22.5 34.17±3.71* 52.80±4.50 40.75±4.09 34.56±4.53 67.5 32.94±4.73* 41.77±5.07* 36.48±6.49 30.50±3.46微米SiO2組 7.5 48.20±5.40 64.77±4.08 46.83±5.19 39.67±4.16 22.5 40.67±6.10 57.67±7.15 42.84±5.10 36.09±5.44 67.5 38.06±5.17* 58.43±6.45 43.52±4.76 35.16±6.50

2.3 納米和常規(guī)微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織TBARS水平的影響(表3) 由表3可知，隨著劑量逐漸增加，20 nm SiO2和60 nm SiO2均可引起大鼠肺、肝和睪丸TBARS含量逐漸升高。在67.5 mg/kg劑量下，20 nm SiO2和60 nm SiO2組的肺、肝和睪丸組織TBARS含量與陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且20 nm SiO2組大鼠心臟TBARS含量與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其他各實驗組大鼠心臟TBARS含量與陰性對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，在22.5 mg/kg劑量下，肺、肝組織TBARS含量也顯著低于陰性對照組(P＜0.05)。微米SiO2使肺組織TBARS含量升高(P＜0.05)。

表3 納米和常規(guī)微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織TBARS水平的影響(±s，n＝8，nmol/mgprot)

表3 納米和常規(guī)微米SiO2對大鼠肺、肝、心、睪丸組織TBARS水平的影響(±s，n＝8，nmol/mgprot)

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量(mg/kg) 肺臟 肝 心 睪丸陰性對照組 0 0.31±0.02 0.42±0.03 0.32±0.01 0.29±0.01 20 nm SiO2組 7.5 0.33±0.05 0.43±0.04 0.33±0.03 0.31±0.03 22.5 0.43±0.02* 0.52±0.02* 0.37±0.04 0.33±0.03 67.5 0.51±0.03** 0.59±0.03* 0.49±0.02* 0.42±0.02*60 nm SiO2組 7.5 0.30±0.04 0.41±0.02 0.36±0.02 0.33±0.04 22.5 0.41±0.04* 0.45±0.05 0.35±0.01 0.34±0.04 67.5 0.43±0.04* 0.55±0.03* 0.38±0.03 0.40±0.02*微米SiO2組 7.5 0.35±0.03 0.42±0.05 0.33±0.02 0.29±0.01 22.5 0.40±0.02* 0.45±0.02 0.34±0.04 0.30±0.05 67.5 0.43±0.03* 0.43±0.02 0.33±0.04 0.32±0.02

3 討論

目前，關(guān)于納米材料對生物機體所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)機制方面研究，主要關(guān)注的是納米物質(zhì)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)學(xué)說[6-7]。納米材料進入機體后引起生物體產(chǎn)生過量的活性氧(ROS)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)及其他的毒性效應(yīng)。但目前關(guān)于納米材料的氧化損傷方面研究，主要是集中在肺組織的氧化損傷研究，尚缺乏對肺外其他組織氧化損傷的系統(tǒng)研究。因此，本研究通過氣管灌注法將不同粒徑的納米SiO2和常規(guī)微米SiO2對實驗動物染毒，通過檢測肺、肝、心、睪丸組織的SOD和GSH-Px酶活性及TBARS水平改變，探討不同粒徑的納米SiO2和常規(guī)微米SiO2對肺、肝、心、睪丸組織的氧化損傷作用。

SOD是在機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的酶，SOD具有清除氧陰離子自由基和抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護細(xì)胞免受損傷的作用，GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)抗過氧化、保護肺泡巨噬細(xì)胞膜性系統(tǒng)的重要酶系，主要通過消除過氧化氫，保護組織細(xì)胞免受自由基的損傷。正常情況下，生物機體通過抗氧化酶，如SOD、GSH-Px等組成的防御系統(tǒng)抵抗自由基對生物機體的損傷[8]。SOD、GSH-Px活性降低和TBARS水平升高表明生物機體抗氧損傷化功能降低、脂質(zhì)過氧化增強，生物機體可能受到一定程度的氧化損傷。

本研究結(jié)果表明，20 nm SiO2使肺臟、肝臟、心肌、睪丸組織的SOD、GSH-Px酶活性顯著降低及TBARS水平明顯升高(P＜0.05)，且在22.5 mg/kg劑量下，20 nm SiO2組的肺、肝組織SOD、GSH-Px酶活性也顯著低于對照組(P＜0.05)；60 nm SiO2均可引起肺、肝、睪丸組織的SOD和GSH-Px酶活性顯著降低及TBARS水平明顯升高(P＜0.05)；而微米SiO2只引起肺組織SOD、GSH-Px酶活性降低及TBARS水平明顯升高(P＜0.05)。這一結(jié)果表明納米SiO2對實驗大鼠肺、肝、心、睪丸組織均有不同程度的氧化損傷作用，其中對肺臟的損傷最大，肝臟次之，睪丸組織較小，心臟最小，且20 nm SiO2的毒性作用強于60 nm SiO2的毒性作用，而微米SiO2僅對肺組織產(chǎn)生較明顯的氧化損傷作用。這一結(jié)果也說明納米SiO2可以對生物機體肺、肝、心、睪丸等多個組織器官具有毒性作用，粒徑越小，且其毒性作用愈強，其毒性機制可能是通過破壞組織的氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡，對細(xì)胞膜產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致氧化損傷所致。因此氧化應(yīng)激引起的氧化損傷可能是納米SiO2毒性作用的機制之一。納米材料是具有納米尺度特殊理化性質(zhì)的顆粒物質(zhì)，其與機體的作用方式、作用途徑、作用機制是一個極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，但具體機制還需進一步探討。本研究結(jié)果也表明，納米材料的潛在毒性作用可能是非常廣泛的、涉及多組織器官的損害，對此目前本實驗室正在進行研究中。

[1]Shiekh FA，Miller VM，Lieske JC.Do calcifying nanopaticles promote nephrolithiasis?A review of the evidence[J].Chin Nephrol，2009，71(1)：1-8.

[2]Jong SP，Young JP，Jong H.Solidification and recycling of incinerator bottom ash through the addition of colloidal silica(SiO2)solution[J].Waste Management，2007，27(9)：1207-1212.

[3]王亞強，李玉平，鄭廷秀，等.超細(xì)二氧化硅改性及其在建筑涂料中的應(yīng)用[J].非金屬礦，2004，27(3)：18-19.

[4]陳國永，廖巖，馬昱，等.納米顆粒物生物安全性研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)：衛(wèi)生學(xué)分冊，2007，34(4)：206-209.

[5]Oberdorster G，Oberdorster E，Oberdorster J.Nanotoxicology：an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles[J].Environ Health Perspect，2005，113(7)：823-839.

[6]Nel A，Xia T，Madler L，et al.Toxic potential of materials at the nanolevel[J].Science，2006，311(5761)：622-627.

[7]Oberd rster G，Oberd rster E，Oberd rster J.Nanotoxicology：an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles[J].Environ Health Perspect，2005，113(7)：823-839.

[8]Singh R，Pathak DN.Lipid peroxidation and glutathione peroxidase，glutathione reductase，superoxide dismutase，catalase，and glucose-6-phosphate dehydrogenase activities in FeCl3-induced epileptogenic foci in the rat brain[J].Epilepsia，1990，31(1)：15-26.