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    過敏組學(xué)的研究概況及其在食物過敏中的應(yīng)用

    2014-12-03 23:19:54胡艷連高金燕楊安樹吳志華陳紅兵南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江西南昌007江西省宜春市人民醫(yī)院江西宜春6000南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院江西南昌007南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院江西南昌007
    食品工業(yè)科技 2014年14期
    關(guān)鍵詞:過敏原組學(xué)轉(zhuǎn)基因

    佟 平,胡艷連,高金燕,李 欣,,楊安樹,吳志華,,陳紅兵,,*(.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌007;.江西省宜春市人民醫(yī)院,江西宜春6000;.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江西南昌007;.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西南昌007)

    過敏組學(xué)的研究概況及其在食物過敏中的應(yīng)用

    佟 平1,胡艷連2,高金燕3,李 欣1,3,楊安樹4,吳志華1,4,陳紅兵1,4,*
    (1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌330047;2.江西省宜春市人民醫(yī)院,江西宜春336000;3.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江西南昌330047;4.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西南昌330047)

    近年來,食物過敏現(xiàn)象日益普遍,引起過敏的蛋白日益受到關(guān)注,過敏組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。本文就過敏組學(xué)的概念、過敏組學(xué)的研究方法以及過敏組學(xué)在食物過敏中的應(yīng)用做了介紹。

    過敏組學(xué),過敏原,食物過敏

    組學(xué)技術(shù)是近年來在生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域快速發(fā)展,并受到高度重視的現(xiàn)代分析技術(shù)。“組”的概念來源于希臘語,最初用于基因組,指一個(gè)物種的全部遺傳組成。發(fā)展到現(xiàn)在,“組”的使用已經(jīng)擴(kuò)展到其他相關(guān)領(lǐng)域,如蛋白質(zhì)組、代謝組等。隨著過敏現(xiàn)象的日益增多,過敏原蛋白日益受到關(guān)注,人們對(duì)過敏原蛋白開展了大量的研究,過敏組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。

    1 過敏組學(xué)概念的提出

    過敏組學(xué)(allergenomics)的概念最早見諸于文獻(xiàn)是在2004年的《International Archives of Allergy and Immunology》雜志上,由Yagami等提出[1]。他們指出傳統(tǒng)的分析過敏原蛋白的方法通常是先分離出各個(gè)過敏原蛋白,然后對(duì)過敏原蛋白進(jìn)行鑒定,再對(duì)其致敏性進(jìn)行表征。這一過程非常繁瑣、耗時(shí),并且工作量大。而隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,以及蛋白質(zhì)序列庫的完善,運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來分析潛在的過敏原成分將會(huì)是一種簡(jiǎn)單快速的方法。他們通過運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)乳膠中的潛在過敏原進(jìn)行識(shí)別驗(yàn)證,證實(shí)了運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究過敏原是一種快速全面分析潛在過敏原的有效途徑。因此,他們結(jié)合了過敏原(allergen)和蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)兩個(gè)單詞,提出過敏組學(xué)(allergenomics)這一概念,即運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法來解析過敏原蛋白的一門學(xué)問。隨后,過敏組學(xué)概念開始被引用。

    2 過敏組學(xué)常用的研究方法

    過敏組學(xué)的研究方法包括蛋白質(zhì)組學(xué)研究的三大支柱技術(shù)——雙向電泳(two-dimensional electrophoresis,2-D電泳)、質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)和生物信息學(xué),以及免疫學(xué)技術(shù)——免疫印跡。其中,以2-D電泳、免疫印跡技術(shù)和MS技術(shù)為支撐平臺(tái),用于過敏原蛋白的分離、鑒定,以生物信息學(xué)為橋梁,利用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和生物學(xué)軟件進(jìn)行大規(guī)模的數(shù)據(jù)處理,對(duì)潛在的過敏原蛋白進(jìn)行解析。

    2.1 雙向電泳

    2-D電泳是20世紀(jì)70年代O’Farrell建立的蛋白質(zhì)分離技術(shù)[2],是等電聚焦電泳(isoelectric focusing,IEF)和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophresis,SDS-PAGE)的組合,即先利用IEF的方法分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì),再通過SDS-PAGE將分子量不同的蛋白質(zhì)在二維平面上分開,從而達(dá)到有效分離蛋白質(zhì)的目的。最初,由于IEF在兩性電解質(zhì)膠管中進(jìn)行,存在操作復(fù)雜、聚焦時(shí)間長、pH不穩(wěn)定、陰性漂移等缺陷,自20世紀(jì)80年代開始,通過采用固定化pH梯度膠,克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等許多缺點(diǎn),并且可隨意精確設(shè)定pH梯度,提高了實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性、重復(fù)性及分辨率,這是雙向凝膠電泳技術(shù)上的一個(gè)非常重要的突破。

    2.2 免疫印跡

    免疫印跡技術(shù)是一種將凝膠電泳和免疫分析技術(shù)有機(jī)地融為一體的分析技術(shù),是蛋白電泳技術(shù)的延伸和發(fā)展。該技術(shù)由Towbin等首次介紹[3],隨后被迅速傳播,應(yīng)用非常廣泛。其原理是混合樣品經(jīng)凝膠電泳后分離,凝膠中的蛋白質(zhì)用電印跡方法被轉(zhuǎn)移到化學(xué)惰性的高分子轉(zhuǎn)移膜上。然后,將目的蛋白的特異性一級(jí)抗體(一抗)與轉(zhuǎn)移膜上的目的蛋白進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng),再用標(biāo)記過(如辣根過氧化物酶標(biāo)記)的二級(jí)抗體(二抗)與一抗結(jié)合,利用對(duì)二抗分子中標(biāo)記物的檢測(cè)證明目的蛋白的存在。

    2.3 質(zhì)譜

    質(zhì)譜是帶電原子、分子或分子碎片按質(zhì)荷比(或質(zhì)量)的大小順序排列的圖譜,由Thomson發(fā)明。其原理[4]是將樣品離子化后,根據(jù)各離子間質(zhì)荷比(m/z)的差異分離蛋白質(zhì),并確定其相對(duì)分子質(zhì)量,能快速、準(zhǔn)確地鑒定蛋白質(zhì)組分,并準(zhǔn)確測(cè)定肽和蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸序列和翻譯后的修飾,具有高通量、靈敏度和準(zhǔn)確度高、易于自動(dòng)化等特點(diǎn),是蛋白質(zhì)組學(xué)、也是過敏組學(xué)最主要的鑒定技術(shù)。依據(jù)蛋白質(zhì)鑒定質(zhì)譜電離源的不同分為兩種:基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDITOF-MS)和電噴霧離子串聯(lián)質(zhì)譜(electrospray ionization tandem mass spectrometry,ESI-MS-MS),前者利用吸收激光的能量使固相的多肽樣品離子化,得到酶解肽段的分子量,獲得蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜,通過相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì),特別適用于分析多肽和蛋白質(zhì)的混合物;后者則在噴射過程中利用電場(chǎng),使液相的多肽樣品離子化,采用串聯(lián)質(zhì)譜的方法,進(jìn)行肽的測(cè)序,不僅能獲得肽段質(zhì)量,而且能獲得肽段氨基酸序列信息。目前,這兩種質(zhì)譜在過敏組學(xué)中都有廣泛的應(yīng)用。

    2.4 生物信息學(xué)

    生物信息學(xué)的核心是蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的建立和完善。通過對(duì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲(chǔ)、檢索與分析,解釋數(shù)據(jù)所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義,同時(shí)為蛋白質(zhì)的鑒定、結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測(cè)提供依據(jù)。生物信息學(xué)技術(shù)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合主要對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選和鑒定。許多國家和地區(qū)的研究機(jī)構(gòu)都建立了自己的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,其中最具代表性的是SWISSPROT,為世界上使用最廣泛的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫[4],可提供蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)域、翻譯后的修飾、突變體的描述等信息,并且這些信息會(huì)及時(shí)更新。

    3 過敏組學(xué)在食物過敏中的應(yīng)用

    3.1 識(shí)別潛在的食物過敏原

    運(yùn)用過敏組學(xué)技術(shù)識(shí)別潛在的過敏原,主要是利用2-D電泳與免疫印跡相結(jié)合,首先復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物通過IEF和SDS-PAGE電泳有效分離,再通過電轉(zhuǎn)技術(shù)將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,然后利用過敏患者血清來檢測(cè)與過敏患者血清中IgE結(jié)合的蛋白,從而確定潛在的致敏蛋白。這種方法可有效地分離蛋白,同時(shí)可全面檢測(cè)出多種與IgE結(jié)合的潛在過敏蛋白。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)可對(duì)識(shí)別的潛在過敏原蛋白進(jìn)行定性分析,通過比對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,鑒定出潛在過敏原的蛋白質(zhì)種類。目前該組合技術(shù)已廣泛被應(yīng)用。如Beyer等利用2-D免疫印跡與質(zhì)譜測(cè)序的方式鑒別出了榛子過敏原Cor a 9[5]。Pastorello等也利用該組合技術(shù)鑒別出了6種玉米過敏原,并發(fā)現(xiàn)其中兩種過敏原與葡萄可能存在交叉反應(yīng)[6]。Boldt等[7]和Chassaigne等[8]分別利用2-D電泳和不同的質(zhì)譜方法鑒別出了花生過敏原Ara h 1,Ara h 2,Ara h 3,Ara h 4及Ara h 3的同分異構(gòu)體。Akagawa等[9]和Sotkovsky等[10]也分別利用不同的質(zhì)譜技術(shù)分別鑒別出了4種小麥過敏原和19種小麥過敏原。此外,該技術(shù)還被用于鑒別蝦[11]、雞蛋[12]過敏原,以及一些不常引起過敏的食物中的過敏原,比如桃子[13]、板栗[14]、西紅柿[15]、萵苣[16]等。但該技術(shù)也存在一定的缺陷,即所識(shí)別的只是潛在過敏原,而不能確定所識(shí)別的一定是過敏原。因?yàn)槔迷摷夹g(shù)所識(shí)別的蛋白雖然能與過敏患者血清中的IgE結(jié)合,但并不是所有能與IgE結(jié)合的蛋白都具有致敏性。過敏原除了必須能與過敏患者血清中的IgE結(jié)合,還要能與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上的IgE受體(FcεRⅠ受體)結(jié)合。因此,要想利用過敏組學(xué)技術(shù)確認(rèn)所識(shí)別的蛋白是否具有致敏性,還需進(jìn)一步采取口服激發(fā)或者皮試來驗(yàn)證。

    3.2 定量加工食品中的過敏原含量

    非常微量的過敏原也可能引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。因此,目前許多國家都要求食品生產(chǎn)廠家在食品包裝上標(biāo)明過敏原成分。由于在食品生產(chǎn)過程中可能存在過敏原交叉污染,加工食品中過敏原種類及含量的檢測(cè)就變得尤為重要。ELISA是常用檢測(cè)食物組分中過敏原含量的一種方法,但由于該方法需要使用過敏原特異性的抗體,限制了它的應(yīng)用。在過敏組學(xué)中,通過選擇過敏原蛋白的特征肽段進(jìn)行質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè),也可以對(duì)食品中的過敏原進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。比如Careri等利用LC-ESI-MS/MS技術(shù)建立了一種基于檢測(cè)目標(biāo)肽來定量食物中花生過敏原的方法[17]。他們首先利用LC-ESI-Q TOF MS/MS技術(shù)從花生過敏原Ara h 2和Ara h 3/4中找出四個(gè)花生過敏原特征肽,然后利用這四個(gè)特征肽及質(zhì)譜中的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)來篩查食品中的花生過敏原,利用外標(biāo)法檢測(cè)了食物樣品中花生過敏原的含量,最低檢測(cè)限可達(dá)到1μg/g食品。隨后,該技術(shù)被分別用于堅(jiān)果[18-19]、牛奶[20-22]、雞蛋[23]、大豆[24]和蝦[25]等食物中過敏原的定量分析。此外,Heick等利用LC/MS/MS技術(shù)建立了一種同時(shí)檢測(cè)焙烤食物中多種過敏原的方法,也獲得了成功[26]。他們還以面包為例,分別用該方法和商品化的ELISA試劑盒對(duì)焙烤前后面包中的牛奶、雞蛋、花生、大豆、榛子、核桃和杏仁7類過敏原進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)焙烤對(duì)不同方法檢測(cè)出的結(jié)果有影響,其中以對(duì)面包中牛奶過敏原的檢測(cè)影響最大。應(yīng)用過敏組學(xué)方法檢測(cè)加工食品中的牛奶過敏原具有較高的檢測(cè)靈敏度,而用ELISA方法則檢測(cè)不到。因?yàn)镋LISA方法主要是利用其試劑盒中所含的抗體與加工的食品結(jié)合來檢測(cè)的,而食品加工方法可能會(huì)破壞或者部分破壞食品中與抗體結(jié)合的表位,尤其是構(gòu)象性表位,導(dǎo)致其與抗體結(jié)合的能力下降,因而用ELISA方法檢測(cè)不出,但這種破壞并不會(huì)對(duì)質(zhì)譜分析產(chǎn)生多大影響。此外,在定量加工食品中的過敏原方面,過敏組學(xué)方法不會(huì)出現(xiàn)像ELISA法中常出現(xiàn)的假陽性和假陰性。由此可見,過敏組學(xué)方法在加工食品中痕量過敏原的檢測(cè)和定量具有明顯優(yōu)勢(shì)。

    3.3 應(yīng)用過敏組學(xué)技術(shù)評(píng)估新食品的安全性

    近年來,隨著轉(zhuǎn)基因食品種類的豐富和數(shù)量的增加,其安全性也引起了廣泛關(guān)注。其中轉(zhuǎn)基因食品的致敏性對(duì)于過敏患者來說尤為重要。目前人們利用過敏組學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的致敏性進(jìn)行了大量的研究。Batista等對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的蛋白組進(jìn)行了研究,并利用2D電泳和免疫印跡技術(shù)評(píng)估了轉(zhuǎn)基因大豆的致敏性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆過敏患者對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆的識(shí)別無差異,但是從轉(zhuǎn)基因大豆中多識(shí)別了2種潛在過敏原[27]。Nakamura等對(duì)轉(zhuǎn)基因土豆的安全性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因土豆與非轉(zhuǎn)基因土豆在蛋白表達(dá)上略有差異,其中轉(zhuǎn)基因土豆表達(dá)的過敏原馬鈴薯糖蛋白前體的量比非轉(zhuǎn)基因土豆稍多,但兩者對(duì)土豆過敏患者血清中的IgE的識(shí)別基本相同[28]。Fonseca等對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MON 810的免疫學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了評(píng)估,并發(fā)現(xiàn)了在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米中均存在14種新的IgE結(jié)合蛋白[29]。Thelen團(tuán)隊(duì)利用2-D電泳和質(zhì)譜技術(shù)識(shí)別出了大豆、油菜、蓖麻和擬南芥四種油料作物的500多個(gè)蛋白,并繪制了相應(yīng)作物的蛋白圖譜,這些蛋白圖譜可為后續(xù)評(píng)估轉(zhuǎn)基因作物的安全性提供有效數(shù)據(jù)[30]。此外,過敏組學(xué)技術(shù)還常被用于評(píng)估經(jīng)不同加工方法制作的新食品的安全性,如用面筋蛋白澄清后的紅酒[31]、焙烤的曲奇[18]以及經(jīng)高壓、焙烤等處理的堅(jiān)果等[32-37],這樣的應(yīng)用研究很多,在此不一一贅述。

    4 展望

    過敏組學(xué)雖然是新近提出的一項(xiàng)組學(xué),但其作為蛋白質(zhì)組學(xué)的一部分,其研究方法已日趨成熟,未來將會(huì)有更廣泛的應(yīng)用,如在食物過敏原的定性和定量方面,可開發(fā)更簡(jiǎn)單、更精確地定性和定量食物過敏原的方法。此外,可考慮將過敏組學(xué)技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合,在過敏原的篩查與診斷方面做出貢獻(xiàn)。

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    Outlines of study on allergenomics and its application on food allergy

    TONG Ping1,HU Yan-lian2,GAO Jin-yan3,LI Xin1,3,YANG An-shu4,WU Zhi-hua1,4,CHEN Hong-bing1,4,*

    (1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.The People’s Hospital of Yichun City,Yichun 336000,China;3.College of Life Sciences and Food Engineering,Nanchang University,Nanchang 336000,China;4.Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

    Recently,the number of allergic patients is increasing,and the proteins responsible for allergic reactions have attracted much attention.Therefore,allergenomics was proposed.In this paper,the conception,the research technique and the application of allergenomics on food allergy were briefly reviewed.

    allergenomics;allergen;food allergy

    TS201.6

    A

    1002-0306(2014)14-0381-04

    10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.075

    2013-10-28 *通訊聯(lián)系人

    佟平(1984-),女,助理研究員,研究方向:食品營養(yǎng)與安全。

    國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2013AA102205);國家自然科學(xué)基金(31171716,31301524);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助課題(20113601110003);國家國際科技合作專項(xiàng)資助(2013DFG31380);江西省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(20133ACB2009);江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20122BBG70170-2)。

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