基于AFLP技術(shù)對(duì)楨楠實(shí)生白化苗與正常苗的比較研究

張 煒，陳 忠，龍漢利，莊國(guó)慶，李曉清

(1.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川成都 610081，2.內(nèi)江市東興區(qū)雙才林業(yè)工作站，四川內(nèi)江 641100)

白化苗是是葉片中含葉綠素較少或不含葉綠素的植物幼苗。葉綠素的缺失導(dǎo)致植物不能進(jìn)行正常的光合作用和生長(zhǎng)發(fā)育。光合作用對(duì)植物來(lái)說(shuō)是必不可少的，光合作用正常與否，對(duì)植物生長(zhǎng)有重要影響。研究白化苗的成因進(jìn)而控制其形成是當(dāng)前作物育種中亟待解決的一個(gè)問(wèn)題。很多研究發(fā)現(xiàn)在多種農(nóng)作物的實(shí)生苗或組培苗中存在白化苗，如水稻(Oryza sativa L.)［1］、小麥 (Triticumaestivum L.)［2］、大麥 (Hordeumvulgare L.)［3］、高粱 (Sorghum bicolor(L.)Moench)［4］、玉米 (Zea mays L.)［5］、煙草(Nicotianatabacum L.)［6］、棉花 (Gossypiumhirsutum L.)［7］、甘蔗 (Saccharumsinensis Roxb.)［8］、薏苡(Coixlacrymajobi L.)［9］、雷竹(Phyllostachys praecox C.D.Chu et C.S.Chao)［10］。白化苗不但在農(nóng)作物中較為普遍，在樹(shù)木中也有發(fā)現(xiàn)，如蘇鐵(Cycasrevoluta Thunb.)［11］、藍(lán)桉 (Eucalyptus globulus Labill.)［12］、版納省藤 (Calamus nambariensis Becc.var. xishuangbannaensis S. J. Pei etS. Y.Chen)［13］、椰子樹(shù)(Cocos nucifera)［14］。白化苗產(chǎn)生的原因有兩種，一種是由于生理上的變化引起的;另一種是DNA序列產(chǎn)生了突變。生理上的變化是白化苗形成的外因，包括抗生素［15］、磷和鋅［5］、預(yù)處理［16］、低溫［17］、脈動(dòng)磁場(chǎng)［18］、不同雜交材料［19］和不同倍性［20］等因素對(duì)植物產(chǎn)生白化苗的影響。DNA序列的變異可導(dǎo)致白化苗與正常綠苗葉片的超微結(jié)構(gòu)［11，21］、過(guò)氧化物同工酶［22，23，9］、脂酶同工酶［9，22］、可溶性蛋白質(zhì)［22，24］和質(zhì)體亞顯微結(jié)構(gòu)［25］等方面具有明顯的差異，這些差異可能與白化苗的形成有關(guān)。遺傳學(xué)上的研究表明，白化苗遵從單基因分離規(guī)律，認(rèn)為白化苗可以作為評(píng)估樹(shù)木遠(yuǎn)親繁殖率的指標(biāo)［12］，但也有相反的研究結(jié)果［26］。楨楠(Phoebe zhennan S.Lee＆F.N.Wei)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，但目前有關(guān)楨楠的研究較少，有關(guān)楨楠白化苗的研究迄今還未見(jiàn)有報(bào)道?；诖?，本文對(duì)楨楠白化苗與正常苗的AFLP譜帶進(jìn)行了比較分析。

1 材料

本研究的試驗(yàn)材料為楨楠實(shí)生苗。2011年10月份由四川省林業(yè)科學(xué)研究院在四川、云南、重慶、貴州、湖北和湖南6個(gè)省采集苗木種子。按棵采集，每一棵上采到的種子作為一個(gè)家系，共采集92個(gè)家系，每個(gè)家系50棵，2012年3月份將種子播于裝有土壤的塑料花盆中，采用相同的營(yíng)養(yǎng)土質(zhì)栽培、相同的營(yíng)養(yǎng)液澆灌，以及相同的光照、溫度與濕度管護(hù)。

圖1 楨楠正常苗(左)和白化苗(右)

實(shí)驗(yàn)所用的試劑有購(gòu)自Biolabs的限制性內(nèi)切酶EcoRI和 MseI;購(gòu)自天根生物科技有限公司(Tiangen，北京)的 T4連接酶、TaqDNA聚合酶、dNTPs和甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素，瓊脂糖、Tris飽和酚等有機(jī)試劑;購(gòu)自Solarbio公司的親和硅烷、剝離硅烷;由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成引物。

實(shí)驗(yàn)所用到得儀器有電子天平(Sartorious)、高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)(Thermo)、蒸汽滅菌器、Bio-Rad(MC013208)PCR擴(kuò)增儀、水平電泳儀(BIO-RAD)和Gene Genius Bio-imaging System凝膠成像凝膠成像系統(tǒng)、北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYCZ-20C型垂直電泳系統(tǒng)，UV-VIS Spectrophotometer(Tu-1901型)紫外分光光度儀、搖床以及其它一些常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)備。

2 研究方法

2.1 測(cè)定白化苗發(fā)生率

2012年7月統(tǒng)計(jì)每個(gè)家系白化苗的株數(shù)和該家系的總株數(shù)。

白化苗發(fā)生率=每個(gè)家系白化苗的株數(shù)/該家系的總株數(shù)·100%。

2.2 基因組DNA的提取

供試材料種子發(fā)芽后，分別取白化苗和正常苗的新鮮嫩葉，基因組DNA提取參照Z(yǔ)hang等的實(shí)驗(yàn)方法［21］，所得的白化苗基因組DNA和正常苗基因組DNA分別用1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，用Gene Genius Biolmaging Sysetm凝膠成像系統(tǒng)在紫外光下拍照，可以粗略估算出各樣品的DNA濃度，同時(shí)還可檢測(cè)總DNA分子的大小以及是否降解。最后統(tǒng)一將DNA濃度調(diào)整為40 ng·μl-1，均保存于 -20℃冰箱備用。

2.3 AFLP擴(kuò)增

利用實(shí)生苗、白化苗的DNA樣品對(duì)56個(gè)引物組合進(jìn)行了篩選，根據(jù)最終聚丙烯酰胺凝膠上反映出的條帶數(shù)目、清晰度、多態(tài)性以及重復(fù)性情況來(lái)篩選適用的AFLP引物。

PCR 反應(yīng)體系:體積為 25 μl，3 μl模板 DNA，擴(kuò)增引物(50 pm·μl-1)各 1.0 μl，2 μl dNTPs(10 mM·μl-1)，0.2 μl Taq DNA 聚合酶 (5 U·μl-1)，1.5 μl MgCl2(25 mM)，補(bǔ)充超純水至 25 μl。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，65℃退火(每個(gè)循環(huán)降低0.7℃)30 s，72℃延伸1 min，12個(gè)循環(huán);94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，23個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min;置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

反應(yīng)結(jié)束后，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液(98%甲酰胺;10 retool/L EFrA，pH8.0;0.250k溴酚藍(lán);0.25%二甲苯青FF)等體積混合，95℃變性6 min.立刻將PCR管放到冰上待用。本實(shí)驗(yàn)中采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染的方法進(jìn)行檢測(cè)執(zhí)。銀染后的板晾干后在膠片觀察燈下觀察，選擇那些具有清晰、電泳帶易計(jì)數(shù)的引物作為AF'LP反應(yīng)的最佳引物。

3 結(jié)果與分析

3.1 白化苗發(fā)生率

在收集的92個(gè)家系中有5個(gè)家系出現(xiàn)1株～2株白化苗，其白化苗發(fā)生率在2%～4%之間，這與高梁和玉米實(shí)生苗的5%以下的白化苗發(fā)生率相近［4，5］。

3.2 引物篩選結(jié)果

利用實(shí)生苗、白化苗的DNA樣品對(duì)56個(gè)引物組合進(jìn)行了篩選，根據(jù)最終聚丙烯酰胺凝膠上反映出的條帶數(shù)目、清晰度、多態(tài)性以及重復(fù)性情況，選擇出了16個(gè)引物組合，利用這16對(duì)引物檢測(cè)白化苗與正常綠色苗的DNA差異條帶的篩選引物，具體情況見(jiàn)表1。

3.3 AFLP譜帶分析

16對(duì)AFLP引物中，發(fā)現(xiàn)有兩對(duì)引物組合(P6和P11)能在正常苗和白化苗中產(chǎn)生差異條帶。其中引物P6在白化苗樣品中擴(kuò)增的條帶比在正常綠苗少一條，即白化苗缺失一條帶，缺失的這條帶大小為950 bp左右(圖2左)。而引物P11在白化苗樣品中擴(kuò)出的條帶比正常綠苗多一條，即白化苗多一條帶，多出的這條帶的大小為1 150 bp左右(圖2右)。差異條帶的出現(xiàn)說(shuō)明白化苗與正常苗在DNA序列上是有差異的。

表1 AFLP引物篩選結(jié)果表

4 討論

本研究中兩對(duì)差異性篩選引物P6(EACG/MCCG)和 P11(EATC/MCGT)，獲得了兩條差異性DNA片段，重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明這兩條多態(tài)性條帶能夠穩(wěn)定區(qū)分楨楠的白化苗與綠色苗。植物中白化苗性狀成因主要有兩個(gè)，第一是跟DNA序列的突變相關(guān)，另外還可能與植物所處的環(huán)境以及生理上的變化相關(guān)，目前還缺乏兩者相關(guān)的直接證據(jù)。根據(jù)本單位關(guān)于楨楠種子萌發(fā)與幼苗栽培的實(shí)驗(yàn)，我們使用采集的楨楠種子，在四川省林業(yè)科學(xué)研究院繁殖花圃中萌發(fā)并管護(hù)，實(shí)施相同的營(yíng)養(yǎng)土質(zhì)栽培、相同的營(yíng)養(yǎng)液澆灌，以及相同的光照、溫度與濕度管護(hù)，依然發(fā)現(xiàn)了部分白化苗性狀的出現(xiàn)，因此推測(cè)楨楠白化苗的產(chǎn)生可能與環(huán)境生理的差異性原因無(wú)太大關(guān)聯(lián)，而主要源于其體內(nèi)DNA的突變。這也是我們采用AFLP方法，從分子生物學(xué)的基因組學(xué)角度入手研究楨楠白化苗成因的理由。

圖2 引物P6在正常苗中擴(kuò)出的特異性條帶(左)、引物P11在白化苗中擴(kuò)出的特異性條帶(右)

DNA序列發(fā)生差異可能是由堿基突變，堿基或片段的插入，堿基或片段的缺失等引起的。Ellis(1985)研究發(fā)現(xiàn)小麥白化苗的質(zhì)體DNA有大段缺失，不同的白化苗缺失片段及缺失量不同［27］。楊莉等(1998)利用RFLP技術(shù)研究了小麥返白系葉綠體DNA的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系較近的兩個(gè)小麥品種的白化苗的Hind Ш 酶切片段有差異，他們認(rèn)為這種差異可能是由于cDNA發(fā)生點(diǎn)突變，小片段插入或缺失所造成的［28］。張漢堯等(2005)研究表明矮牽牛的白化可能是由于葉綠體DNA水平上的堿基變化所引起的［29］。本研究中，究竟是堿基的突變，還是缺失或插入導(dǎo)致白化苗與正常綠苗的AFLP譜帶發(fā)生差異，還需進(jìn)一步的測(cè)序比較分析，從核苷酸序列水平真正揭開(kāi)楨楠白化苗的基因組突變成因。

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