血府逐瘀湯、天麻鉤藤飲、溫膽湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織MAPK信號(hào)通路的影響

張國(guó)華，楊 光，趙想玲

（1南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州 510515;2南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院）

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，其參與介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂和分化等多種生理及病理過程［1～3］。MAPK信號(hào)途徑作為各種肥厚刺激因子在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的共同通路，在多種致肥大因子介導(dǎo)的心肌細(xì)胞反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［4，5］。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，MAPK亞族主要包括ERK1/2、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5（ERK5），它們對(duì)細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡有重要作用，這幾條通路之間存在相互“對(duì)話”，參與心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)，與心肌肥厚、心肌纖維化密切相關(guān)［6］。血府逐瘀湯、天麻鉤藤飲、溫膽湯分別為平肝潛陽(yáng)、理氣化瘀、活血化瘀的代表方劑;近年來，三方廣泛用于高血壓、心臟病的治療，適用于肝陽(yáng)上亢、痰濁內(nèi)擾、瘀血內(nèi)阻三個(gè)證型;以往研究報(bào)道，三方有抗心肌纖維化的作用，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。2013年10月～2014年8月，我們觀察了血府逐瘀湯、天麻鉤藤飲、溫膽湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織MAPK信號(hào)通路的影響，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 蛋白酶體抑制劑（MG132，美國(guó)Selleck公司），蛋白激酶檢測(cè)試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶（美國(guó)Gibco-BRL公司）;LiquiChip液相芯片分析系統(tǒng)（Qiagen公司）。

1.2 藥物制備 實(shí)驗(yàn)中所用中藥材由南方醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院藥用植物學(xué)和中藥鑒定學(xué)教研室鑒定合格后使用。天麻鉤藤飲組方:天麻9 g，鉤藤12 g（后下），石決明18 g（先煎），梔子 9 g，黃芩 9 g，川牛膝 12 g，杜仲 9 g，益母草9 g，桑寄生9 g，夜交藤9 g，茯苓9 g。溫膽湯組方:半夏 6 g，竹茹 6 g，枳實(shí) 6 g，陳皮 9 g，甘草 3 g，茯苓5 g。血府逐瘀湯組方:桃仁12 g，紅花9 g，當(dāng)歸 9 g，生地 9 g，川芎 5 g，赤芍 6 g，牛膝 9 g，桔梗5 g，柴胡3 g，枳殼6 g，甘草3 g。以上中藥經(jīng)3次煎煮后，過濾去渣，濃縮至1 mL藥液（含1 g生藥），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 16周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠60 只，體質(zhì)量（265.5 ±8.3）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供;許可證編號(hào):SCXK（京）2013-001;級(jí)別:SPF/VAF。60只大鼠隨機(jī)分為陽(yáng)性對(duì)照組、MG132組、天麻鉤藤飲組、溫膽湯組、血府逐瘀湯組各12只。雄性正常血壓大鼠12只，體質(zhì)量（269.1±9.6）g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，設(shè)為陰性對(duì)照組。各組均普通飲食喂養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)，控制室溫為（22±2）℃，濕度為55%±15%，標(biāo)準(zhǔn)飲食。MG132組腹腔注射 MG-132，0.1 mg/（kg·d）［7］;天麻鉤藤飲組、溫膽湯組、血府逐瘀湯組給予相應(yīng)的藥物灌胃，按2 mL/100 g;陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃，2次/d。連續(xù)灌胃8周后斷頭處死，取其心臟稱重，取左室中部冠狀面心肌，即刻放入液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 心肌組織 JNK、p38MAPK、ERK5檢測(cè) 取大鼠心肌組織50 mg，在預(yù)冷的研缽中加入液氮研磨成粉狀，加入組織裂解緩沖液，離心后取上清，定量并分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩２捎肔iquiChip液相蛋白芯片系統(tǒng)檢測(cè)大鼠心肌組織 JNK、p38MAPK、ERK5，操作步驟如下:首先取50 μL待測(cè)心肌組織上清，加入96孔過濾板中，加入25 μL偶聯(lián)有抗細(xì)胞因子抗體的球形基質(zhì)（一抗），漩渦混勻，室溫避光振搖2 h。然后用真空泵從反應(yīng)板底部將各孔中液體除去，加入75 μL檢測(cè)緩沖液，輕輕振搖后，再次抽去液體，每孔加入75 μL檢測(cè)緩沖液和25 μL生物素化的二抗（報(bào)告分子），室溫避光振搖1.5 h;每孔加入25 μL鏈霉親和素偶聯(lián)的藻紅蛋白溶液，室溫避光振搖0.5 h;每孔加入25 μL終止緩沖液，室溫避光振搖5 min后，用真空泵從反應(yīng)板底部將各孔中液體除去，每孔加入125 μL測(cè)定緩沖液，室溫避光振搖1 min;最后在LiquiChip液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)上讀取各孔熒光強(qiáng)度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度得到樣品的細(xì)胞因子濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組大鼠心肌組織JNK、p38MAPK、ERK5表達(dá)比較見表1。

3 討論

高血壓為臨床最常見的慢性疾病，心肌纖維化作為高血壓心肌損害的主要病理基礎(chǔ)，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞外基質(zhì)膠原的過度沉積和肌成纖維細(xì)胞數(shù)目的增多，進(jìn)而影響心室壁動(dòng)度及心室的舒張及收縮功能，從而導(dǎo)致嚴(yán)重心律失常、心功能不全及心源性猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，高血壓心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制和防治措施已成為近年來國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。

表1 各組大鼠心肌組織JNK、p38MAPK、ERK5 表達(dá)比較（pg/mL， ±s）

表1 各組大鼠心肌組織JNK、p38MAPK、ERK5 表達(dá)比較（pg/mL， ±s）

注:與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較，#P＜0.01;與MG132組比較，△P＜0.01;與天麻鉤藤飲組、溫膽湯組比較，▲P＜0.05

組別JNK p38MAPK ERK5陽(yáng)性對(duì)照組 36.40 ±23.55* 126.10 ±12.01* 563.30 ±37.45*24.60 ±18.09 90.50 ±10.29 132.20 ±34.21天麻鉤藤飲組 29.10 ±26.12# 118.20 ±14.11*#△ 263.30 ±41.25*#溫膽湯組 28.50 ±18.23# 113.70 ±12.33*#△ 321.20 ±36.24*#血府逐瘀湯組 26.40 ±19.19# 105.80 ±11.22*#△▲ 222.50 ±39.16*#▲MG132 組 25.70 ±21.15# 99.60 ±13.25*# 198.60 ±33.61*#陰性對(duì)照組

自發(fā)性高血壓大鼠模型是與人類原發(fā)性高血壓遺傳背景極為接近的模型，大鼠6周齡時(shí)血壓開始升高，10周齡時(shí)左室肥厚（LVH）和心肌纖維化已經(jīng)形成，并且隨著鼠齡的增加而逐漸加重［8］。引起高血壓LVH和心肌纖維化的機(jī)制十分復(fù)雜，除與高血壓壓力負(fù)荷及心肌組織內(nèi)多種細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)外，其中與MAPK有密切的關(guān)系。

高血壓病程的進(jìn)展可導(dǎo)致心肌肥厚的發(fā)生，后者可進(jìn)一步促使高血壓病情的惡化。MAPK是細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的一類蛋白質(zhì)，包括ERK1/2、JNK、p38MAPK和ERK5，是與細(xì)胞增殖和肥大調(diào)控關(guān)系最為密切的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激酶，其激活對(duì)促進(jìn)心肌的生長(zhǎng)發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。ERK是主要的生長(zhǎng)相關(guān)刺激的調(diào)控者，心臟靶向表達(dá)ERK1/2的上游激酶MEK-1可持續(xù)激活ERK1/2，磷酸化的ERK1/2蛋白表達(dá)顯著增高，可導(dǎo)致明顯的心室向心性肥厚，ERK5也在心肌肥厚的發(fā)展中起重要的調(diào)控作用［9，10］。JNK 和 p38MAPK 在心肌肥厚代償期表現(xiàn)為活性增加，在失代償期尤其是p38MAPK 則表現(xiàn)為活性降低［11～14］。MG132 也可通過調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路預(yù)防高血壓心肌肥厚的發(fā)生，同時(shí)可通過抑制核因子-κB信號(hào)通路預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化和心肌重塑［15］。

中醫(yī)認(rèn)為，瘀血內(nèi)阻、肝陽(yáng)上亢、痰濁內(nèi)擾是高血壓最常見的臨床證型。血府逐瘀湯、天麻鉤藤飲、溫膽湯分別為活血化瘀、平肝潛陽(yáng)、理氣化痰的代表方。血府逐瘀湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，本方從桃紅四物湯化裁而來，不僅可行血分之瘀滯，而且可解氣分之郁結(jié)，活血而不耗血，袪瘀又能生新，將“血府”之瘀逐去而氣機(jī)暢通，從而諸證悉除。天麻鉤藤飲出自近代胡光慈的《雜病證治新義》，具有平肝潛陽(yáng)、補(bǔ)益肝腎和清熱活血的作用，是中醫(yī)治療肝陽(yáng)上亢型高血壓的經(jīng)典方劑。溫膽湯出自孫思邈的《千金要方》，具有理氣化痰、清膽和胃的作用。近年來，三種方劑廣泛用于高血壓及相關(guān)并發(fā)癥的臨床治療，具有良好的臨床效果。本研究顯示，天麻鉤藤飲組、溫膽湯組、血府逐瘀湯組 JNK、p38MAPK、ERK5表達(dá)較MG132組、陰性對(duì)照組升高，較陽(yáng)性對(duì)照組降低，提示血府逐瘀湯、天麻鉤藤飲、溫膽湯可抑制大鼠心肌組織 JNK、p38MAPK、ERK5的表達(dá)，而血府逐瘀湯較天麻鉤藤飲、溫膽湯抑制作用更為明顯。

［1］ Lawrence MC.The roles of MAPKs in disease［J］.Cell Res，2008，18（4）:436-442.

［2］Shaul YD，Seger R.The MEK/ERK cascade:from signMing specificity to diverse functions［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1773（8）:1213-1226.

［3］Raman M，Chen，Cobb MH.Differential regulation and properties of MAPKs［J］.Oncogene，2007，26（22）:3100-3012.

［4］Pimienta G，Pascual J.Canonical and alternative MAPK signaling［J］.Cell Cycle，2007，6（21）:2628-2632.

［5］Barr RK，Kendrick TS，Bogoyeviteh MA.Identification of the critical features of a small peptide inhibitor of JNK activity［J］.J Biol Chem，2002，277（13）:10987-10997.

［6］Kacimi R，Gerdes AM.Alterations in gprotein and MAP kinase signaling pathways during cardiac remodeling in hypertension and heart failure［J］.Hypertension，2003，41（4）:968-977.

［7］Kuwahara F，Kai H，Tokuda K.Transforming growth factorβ function blocking prevents myocardial fibrosis and diastolic dysfunction in pressure-overloaded rats［J］.Circulation，2002，106（1）:130-135.

［8］ Ares-Carrasco S，Picatoste B，Benito-Martín.Myocardial fibrosis and apoptosis，but not inflammation，are present in long-term experimental diabetes［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297（6）:2109-2119.

［9］Kehat I，Davis J，Tiburcy M，et al.Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 regulate the balance between eccentric and concentric cardiac growth［J］.Circ Res，2011，108（2）:176-183.

［10］Kimura TE，Jin J，Zi M，et al.Targeted deletion of the extracellular signal-regulated protein kinase 5 attenuates hypertrophic response and promotes pressure overload-induced apoptosis in the heart［J］.Circ Res，2010，106（5）:961-970.

［11］Dingar D，Merlen C，Grandy S，et al.Effect of pressure overloadinduced hypertrophy on the expression and localization of p38 MAP kinase isoforms in the mouse heart［J］.Cell Signal，2010，22（11）:1634-1644.

［12］Choukroun G，Hajjar R，F(xiàn)ry S，et al.Regulation of cardiac hypertrophy in vivo by the stress-activated protein kinases/c-JunNH（2）-terminal kinases［J］.J Clin Invest，1999，104（4）:391-398.

［13］Ono K，Han J.The p38 signal transduction pathway:activation and function［J］.Cell Signal，2000，12（1）:1-13.

［14］Takeishi Y，Huang Q，Abe Ji，et al.Src and multiple map kinase activation in cardiac hypertrophy and congestive heart failure under chronic pressure-overload:comparison with acutemechanical stretch［J］.J Mol Cell Cardiol，2001，33（9）:1637-1648.

［15］Ma Y，Chen B，Liu D，et al.MG132 treatment attenuates cardiac remodeling and dysfunction following aortic banding in rats via the NF-κB/TGFβ1pathway［J］.Biochem Pharmacol，2011，81（10）:1228-1236.