胃癌組織中CHD1L表達及其臨床意義

袁存存，焦 鋒，胡 海

(1河南大學附屬鄭州市第一人民醫(yī)院，鄭州450004;2上海交通大學)

侵襲與轉(zhuǎn)移是胃癌預后不良的主要生物學特征。染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白1樣基因(CHD1L)是SNF-2類家族成員，具有高度保守的解旋酶功能，可重組染色質(zhì)、調(diào)控轉(zhuǎn)錄以及調(diào)節(jié)DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)CHD1L陽性表達與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移以及預后密切相關(guān)［2～4］。為探討CHD1L在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們于2011年1月～2013年10月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞株AGS、N87、HGC-27(各1株)、正常胃黏膜上皮細胞GES-1由鄭州市第一人民醫(yī)院中心實驗室液氮凍存。同期于我院腫瘤外科接受手術(shù)的71例胃癌患者的癌組織及其配對癌旁組織(距病灶組織2 cm)石蠟標本(患者男38例，女33例，年齡36～73歲，中位年齡61.6歲;均有完整的臨床資料，且經(jīng)病理檢查確診;腫瘤直徑≤5 cm者35例，＞ 5 cm者36例)，TNM 分期:Ⅰ期、Ⅱ期28例，Ⅲ期、Ⅳ期43例;組織學分級:高分化42例，中低分化29例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例。RPMI 1640培基、小牛血清(Gibco公司)，RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)，PCR試劑盒(Takara公司)，CHD1L基因及GAPDH基因引物 (上海生工公司合成)。RIPA裂解液、PMSF、蛋白定量BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)，鼠抗人CHD1L單克隆抗體(Abcam公司)，兔抗人GAPDH多克隆抗體(Cell signaling technology公司)，免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 胃癌細胞株CHD1L mRNA及蛋白表達檢測將AGS、N87、HGC-27及GES-1細胞置于10% 小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃ 、5%CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度下培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代2～3代后取對數(shù)生長期細胞，分別采用RT-PCR和Western blot法檢測CHD1L mRNA和蛋白表達。

1.2.2 胃癌組織及其癌旁組織CHD1L蛋白表達檢測 采用免疫組化法。71份胃癌及癌旁組織標本均行4 μm連續(xù)切片，S-ABC法染色;二甲苯脫臘，乙醇水化后行抗原修復，4%H2O2阻斷10 min，滴加5%BSA封閉液，37℃封閉1 h，滴加一抗4℃過夜(以自身作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照)，生物素化二抗孵育1 h，顯色，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片。于光鏡(×400)下每張切片選取5個有代表性的區(qū)域，每個區(qū)域選150～200個細胞，按染色細胞比例和顯色強度計分。染色細胞比例計分:未發(fā)現(xiàn)染色細胞為陰性，計0分，染色細胞≤10%、～50%、～80%、＞80%分別計1、2、3、4分;顯色強度計分:未著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計0、1、2、3分。兩項計分的乘積＜4為CHD1L蛋白表達陰性，≥4為陽性。分析CHD1L蛋白表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進行處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細胞系CHD1L mRNA和蛋白表達 3株胃癌細胞 CHD1L mRNA和蛋白均呈高表達，與GES-1細胞比較，P均＜0.05。見圖1。

圖1 AGS、N87、HGC-27 及 GES-1 細胞CHD1L mRNA和蛋白表達

2.2 胃癌組織及癌旁組織CHD1L蛋白表達 胃癌組織及癌旁組織CHD1L蛋白陽性率分別為49.3%(35/71)、11.3%(8/71)，χ2=24.317，P ＜ 0.05。CHD1L蛋白表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。由表1可見，CHD1L蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤直徑無關(guān)，而與腫瘤TNM分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.05)。

表1 CHD1L蛋白表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是多因素、多步驟參與的復雜過程，涉及到癌基因以及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的激活、抑癌基因的缺失等［5］。明確胃癌發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵基因的擴增及激活情況，檢測胃癌關(guān)鍵基因的表達有助于腫瘤的診斷、分期及預后判斷［6，7］。

CHD1L是香港大學關(guān)新元教授用染色體顯微切割結(jié)合篩選雜交技術(shù)從人肝細胞的染色體lq21區(qū)首次分離并克隆的一個新基因［8］。通過對CHDIL基因的同源性和功能結(jié)構(gòu)域的分析研究發(fā)現(xiàn)，其屬于 SNF-2類家族。SNF-2類家族成員如Snf2、ISWI和CHDl均含有一個大約400個氨基酸的結(jié)構(gòu)域，具有高度保守的解旋酶功能。CHDIL與CHDl的解旋酶區(qū)域的同源序列是59%。與CHDl不同的是，CHDIL不包含可以識別甲基化組蛋白末端染色體結(jié)構(gòu)［9］，但其羧基末端包含一個較大的區(qū)域，此為ADP-ribose/PAR-binding元件，可調(diào)控DNA損傷修復和細胞周期演進［10，11］。

研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中CHD1L在基因水平擴增的比例是50.6%(86/140)，蛋白水平過表達的比例是52.4%(163/311);轉(zhuǎn)染CHD1L后的肝癌細胞具有更強的致瘤能力［8］。進一步分析發(fā)現(xiàn)CHD1L的過表達與靜脈浸潤、腫瘤分期高、預后差密切相關(guān)［3，12］。此外，肝癌手術(shù)后患者高表達 CHD1L 者預示著其無疾病生存時間短［13］;膀胱癌組織中CHD1L表達也影響患者的預后以及生存［14］。本研究結(jié)果顯示，3株人胃癌細胞系中CHD1L mRNA和蛋白表達水平均明顯高于正常胃黏膜細胞;71份胃癌組織CHD1L蛋白表達陽性率均明顯高于癌旁組織。有報道胃癌組織與癌旁組織的CHD1L陽性率分別為58.7與7.3%，本研究結(jié)果與其基本一致，但癌旁組織的陽性率似明顯高于其報道，可能與納入研究者個體差異及免疫組化評分標準不同有關(guān)。進一步分析胃癌組織中CHD1L的表達水平與臨床病理因素的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，CHD1L蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)，而與腫瘤TNM分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);即CHD1L蛋白表達陽性率高者腫瘤TNM分期高、分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高。CHD1L促進腫瘤生長以及轉(zhuǎn)移的分子機制可能涉及到以下幾個方面:①下調(diào)腫瘤蛋白p53(TP53)以及TP53蛋白的下游效應基因周期素依賴激酶抑制劑1A，有利于激活周期素E-周期素依賴性激酶2復合物，該復合物能滅活G1/S期磷酸化的視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進細胞快速進入S期，促進DNA合成，從而調(diào)控細胞的增殖及凋亡［3］;②與核受體 4亞族 A組成員 1(NR4A1，又稱Nur77)結(jié)合，抑制Nur77從細胞核移至線粒體內(nèi)，阻礙細胞色素C向細胞質(zhì)釋放，抑制細胞凋亡蛋白酶3和蛋白酶9的活性，進而抑制細胞凋亡［15］;③通過細胞分裂周期42鳥苷酸交換因子介導細胞分裂周期42基因的激活，增強細胞的游動性及誘導絲狀偽足細胞形成及上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，增強腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力［16］。但CHD1L促進胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制如何，是否還存在其他的信號通路，仍有待進一步探究。

分析本研究結(jié)果，CHD1L蛋白陽性表達?？纱龠M腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移;CHD1L表達可作為判定胃癌惡性表型的指標之一。今后需進一步對CHD1L在胃癌中的表達水平進行分級并完善隨訪數(shù)據(jù)，探討CHD1L表達水平與患者預后的關(guān)系。

［1］Pazin MJ，Kadonaga JT.SWI2/SNF2 and related proteins:ATP-driven motors that disrupt protein-DNA interactions［J］.Cell，1997，88(6):737-740.

［2］Ji X，Li J，Zhu L，et al.CHD1L promotes tumor progression and predicts survival in colorectal carcinoma［J］.J Surg Res，2013，185(1):84-91.

［3］Chen L，Chan TH，Yuan YF，et al.CHD1L promotes hepatocellular carcinoma progression and metastasis in mice and is associated with these processes in human patients［J］.J Clin Invest，2010，120(4):1178-1191.

［4］He WP，Zhou J，Cai MY，et al.CHD1L protein is overexpressed in human ovarian carcinomas and is a novel predictive biomarker for patients survival［J］.BMC Cancer，2012，12(9):437.

［5］Cho JY.Molecular Diagnosis for Personalized Target Therapy in Gastric Cancer［J］.J Gastric Cancer，2013，13(3):129-135.

［6］陳剛，陸曉峰.胃癌組織中PCNA、COX-2、p53及EGFR的表達及其與預后的關(guān)系［J］.山東醫(yī)藥，2012(41):39-41.

［7］許俊龍，李玉紅，張杰，等.早期胃癌組織MMP-9、MLVD表達及臨床意義［J］.山東醫(yī)藥，2012(31):41-42.

［8］Ma NF，Hu L，F(xiàn)ung JM，et al.Isolation and characterization of a novel oncogene，amplified in liver cancer 1，within a commonly amplified region at 1q21 in hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2008，47(2):503-510.

［9］Chen L，Chan TH，Guan XY.Chromosome 1q21 amplification and oncogenes in hepatocellular carcinoma［J］.Acta Pharmacol Sin，2010，31(9):1165-1171.

［10］Gottschalk AJ，Timinszky G，Kong SE，et al.Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(33):13770-13774.

［11］Kokavec J，Podskocova J，Zavadil J，et al.Chromatin remodeling and SWI/SNF2 factors in human disease［J］.Front Biosci，2008，13(5):6126-6134.

［12］Chen L，Yuan YF，Li Y，et al.Clinical significance of CHD1L in hepatocellular carcinoma and therapeutic potentials of virus-mediated CHD1L depletion［J］.Gut，2011，60(4):534-543.

［13］Hyeon J，Ahn S，Park CK.CHD1L Is a Marker for Poor Prognosis of Hepatocellular Carcinoma after Surgical Resection［J］.Korean J Pathol，2013，47(1):9-15.

［14］Tian F，Xu F，Zhang ZY，et al.Expression of CHD1L in bladder cancer and its influence on prognosis and survival［J］.Tumour Biol，2013，34(6)，3687-3690.

［15］Chen L，Hu L，Chan TH，et al.Chromodomain helicase/adenosine triphosphatase DNA binding protein 1-like(CHD1l)gene suppresses the nucleus-to-mitochondria translocation of nur77 to sustain hepatocellular carcinoma cell survival［J］.Hepatology，2009，50(1):122-129.

［16］Jou J，Diehl AM.Epithelial-mesenchymal transitions and hepatocarcinogenesis［J］.J Clin Invest，2010，120(4):1031-1034.