TK基因治療庫欣病的實驗研究

宋慶鑫，王建鵬，陰曉峰，相恒偉，劉 霞，張 欣，孫 鵬

(1青島大學醫(yī)學院臨床系，山東青島266071;2青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院黃島分院)

庫欣病是由于垂體促腎上腺皮質激素(ACTH)腺瘤或ACTH細胞增生，使垂體分泌過量ACTH引起腎上腺皮質增生、皮質醇增多癥、物質代謝紊亂和一系列病理變化。當腫瘤＜1 cm時可通過手術切除，治愈率為75%～80%［1］;腫瘤較大時治愈率則低于50%［2］。藥物治療和放射治療為庫欣病的輔助療法，但治療效果不明顯［3，4］。隨著分子生物學的發(fā)展，很多遺傳疾病和腫瘤已經(jīng)嘗試行基因治療，采用腺病毒載體轉染有毒基因進入目的細胞，可達到殺死腫瘤細胞的目的［5、6］?；虻陌邢蛐员磉_是基因治療的一個重要因素，要求腺病毒轉染的基因必須高水平表達且能選擇性的在特定細胞中表達。2013年9月～2013年11月，我們觀察了阿黑皮素原(POMC)啟動子調控的單純孢疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因(以下簡稱TK基因)在小鼠AtT20細胞中的靶向性表達，現(xiàn)分析結果，探討其用于庫欣病治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠垂體瘤細胞 AtT-20/D16v-F2(以下簡稱AtT20)購自上海浩然生物技術有限公司;人乳腺癌細胞T47D購自上海艾研生物科技有限公司;腺病毒載體AdPOMCTK購自北京諾賽基因組研究中心公司;非放射性細胞增殖檢測試劑盒購自武漢天源生物技術有限公司。核苷類似物更昔洛韋(GCV)購自湖北科益藥業(yè)股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 小鼠AtT20細胞于含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基中培育，T47D細胞于在含有10%FBS的RPMI培養(yǎng)基中培育;培養(yǎng)基中均含有濃度為100 U/mL的青霉素及鏈霉素。所有培養(yǎng)基均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細胞增殖至對數(shù)生長期時用于研究。

1.2.2 細胞轉染及TK基因表達檢測 將對數(shù)生長期AtT20細胞和T47D細胞按2×105/mL的密度分別接種于12孔板。培養(yǎng)24 h后，分別采用感染復數(shù)(MOI)為10 PFU/cell的AdPOMCTK轉染細胞(轉染組)，空白組替換成等量PBS溶液。轉染48 h后，用PBS沖洗細胞2次，再將細胞置于0.3 mL的緩沖液中。將樣品在干冰乙醇浴中冷卻后置于37℃水浴，重復3次。裂解細胞，將裂解液置于離心管中，4℃離心20 min，上清液置于-70℃保存。提取蛋白，用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝膠電泳后將蛋白質電轉到硝酸纖維素膜上;用含5%脫脂奶粉的TBST常溫密閉2 h后，加入一抗:兔源多克隆HSV-TK抗體(1∶800)，4℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗10 min×3次后加入二抗:HRP標記的goat anti-rabbit IgG，常溫1 h;TBST緩沖液漂洗10 min×3次;顯色，壓片，顯影，定影;觀察TK基因表達。

1.2.3 細胞轉染后對GCV的敏感性檢測 將對數(shù)生長期AtT20細胞和T47D細胞以5×103/mL的密度接種于 96 孔板中 ，分別采用 MOI為 0、0.5、1、5、10、100 PFU/cell的AdPOMCTK轉染;轉染1 h后，以分別加入0、0.5、2.5和5 mg/mL濃度的 GCV 和新鮮培養(yǎng)基，每2天添加1次，第4天應用非放射性細胞增殖檢測試劑盒測定轉染后AtT20細胞對GCV的敏感性，即細胞存活率。實驗重復3次。細胞存活率=GCV干預細胞的吸光度/GCV未干預細胞的吸光度×100%。

1.2.4 旁觀者效應觀察 將轉染與未轉染 Ad-POMCTK 的 AtT20 細胞分別以 1∶4、2∶3、3∶2 和 4∶1的比例混合，以4×103個/mL的密度接種于96孔板中。培養(yǎng)1 d后，實驗組加入濃度為10 μg/mL的GCV，對照組加入等量PBS溶液，每隔2天添液1次。4 d后檢測細胞存活率。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件行統(tǒng)計學分析。不同更昔洛韋濃度及MOI轉染濃度間細胞存活率差異的比較采用析因設計的方差分析法，不同轉染方式間細胞存活率的差異比較采用成組設計的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞轉染后TK基因表達 轉染后48 h，AtT20細胞有明顯的蛋白條帶，分子量為46 K。T47D細胞無明顯蛋白條帶，空白組完全沒有目的基因表達。說明TK基因已轉染入AtT20細胞，并成功表達。見圖1。

圖1 AtT20細胞轉染后TK基因表達

2.2 細胞轉染后對GCV的敏感性 ①AtT20細胞:細胞存活率隨MOI的升高而降低(F=448110.467，P＜0.001);隨 GCV濃度升高而降低(F=360780.586，P ＜0.001);GCV 濃度與 MOI濃度間存在顯著的交互效應(F=28574.837，P ＜0.001)。在各MOI濃度時，細胞存活率均隨GCV濃度增加而降低。當GCV濃度為0 mg/L時，除0.5與1的MOI濃度間差異不顯著外，其它兩兩比較均有顯著差異;當GCV濃度為0.5～5 mg/L時，細胞存活率均隨MOI濃度增加而降低。見表1。②T47D細胞:細胞存活率隨GCV 濃度升高而降低 (F=3.243，P=0.027);隨MOI濃度升高而降低(F=1874.888，P ＜0.001);GCV 濃度與MOI濃度間的交互作用不顯著(F=0.293，P=0.995)。見表2。

表1 不同GCV濃度及MOI濃度作用后AtT20 細胞存活率比較(n=4， ±s)

表1 不同GCV濃度及MOI濃度作用后AtT20 細胞存活率比較(n=4， ±s)

GCV0 mg/L GCV0.5 mg/L GCV2.5 mg/L GCV5 mg/L 0 99.00 ±0.37 99.65 ±0.24 94.95 ±0.13 91.95 ±0.MOI(PUF/cell)細胞存活率(%)24 0.5 99.60 ±0.18 69.03 ±0.13 53.05 ±0.13 40.00 ±0.18 1 99.50 ±0.22 44.33 ±0.13 35.90 ±0.14 29.18 ±0.13 5 98.55 ±0.17 26.33 ±0.17 18.83 ±0.15 17.03 ±0.13 10 98.08 ±0.13 23.20 ±0.14 16.05 ±0.13 7.55 ±0.21 100 34.23 ±0.21 11.28 ±0.13 7.68 ±0.22 4.98 ±0.28

表2 不同GCV濃度及MOI濃度作用后T47D 細胞存活率比較(n=4，±s)

表2 不同GCV濃度及MOI濃度作用后T47D 細胞存活率比較(n=4，±s)

GCV0 mg/L GCV0.5 mg/L GCV2.5 mg/L GCV5 mg/L 0 98.60 ±0.75 98.95 ±0.97 98.38 ±0.83 98.20 ±0.MOI(PUF/cell)細胞存活率(%)88 0.5 98.88 ±0.83 98.05 ±1.10 98.13 ±0.91 98.03 ±0.97 1 98.83 ±0.79 98.40 ±0.42 97.80 ±1.12 97.80 ±0.77 5 98.38 ±0.69 98.03 ±0.86 97.98 ±0.88 97.85 ±0.47 10 98.00 ±0.51 98.23 ±0.71 97.90 ±0.68 97.50 ±0.71 100 77.25 ±1.05 76.78 ±0.41 76.58 ±0.72 76.55 ±0.79

3 討論

在激素分泌性垂體腺瘤中庫欣病占5%～10%，由于垂體分泌過量ACTH，引起腎上腺皮質增生，產(chǎn)生皮質醇增多，引起下丘腦—垂體—腎上腺軸機能紊亂，導致一系列物質代謝紊亂和病理變化。庫欣病是一種耗竭性疾病，很少能自行緩解，若不及時診治，死亡率較高。經(jīng)鼻—蝶竇垂體手術為治療庫欣病的有效方法［7］，但多數(shù)患者仍難以治愈。

近年來基因治療成為腫瘤治療的新策略?；蛑委煹淖畲髥栴}是基因的特異性表達，毒性基因在特定細胞中表達成為一個重要的突破點。研究表明POMC啟動子可以在AtT20細胞中很好的表達。本研究證實帶POMC啟動子的腺病毒載體能轉染入AtT20細胞中并成功表達，在T47D細胞中卻不能明顯表達，說明腺病毒載體的轉染具有靶向性。毒性基因通常選用HSV-TK基因，應用人工合成的核苷類似物GCV激活TK基因，從而產(chǎn)生細胞毒性作用。腫瘤細胞內(nèi)TK基因表達的胸苷激酶可催化GCV形成單磷酸化產(chǎn)物，并在細胞內(nèi)磷酸激酶的作用下形成三磷酸 GCV，后者可阻礙 DNA 合成［9，10］。通過調節(jié)GCV劑量來激活毒性基因的方法為垂體腺瘤的治療提供了一個嶄新的視角和可行的方案。TK基因在腫瘤治療方面具有明顯優(yōu)勢，其誘導形成的三磷酸GCV僅對分裂期細胞產(chǎn)生毒性，而對低有絲分裂指數(shù)的正常細胞無毒性作用，即其殺傷作用僅局限于腫瘤細胞［11］。此為其治療腫瘤提供了可靠的理論依據(jù)［12］。

TK基因作為毒性基因的另一好處是其具有旁觀者效應［13］。這種效應反映了HSV-TK誘導的三磷酸GCV可通過細胞間隙連接細胞與細胞之間的聯(lián)系，從而殺死相鄰的細胞。本研究發(fā)現(xiàn)當腫瘤細胞中只有20%表達TK基因就產(chǎn)生對GCV明顯的敏感性;而感染相同數(shù)量的AdPOMCTK細胞經(jīng)GCV治療后可引起95%以上的細胞死亡，證實TK基因治療庫欣病具有良好的效果。

本研究結果顯示，AdPOMCTK可在AtT20細胞中有效表達有毒基因，且具有靶向性。AdPOMCTK及其類似的病毒載體有望用于庫欣病的基因治療。目前需解決的問題是需進一步確定重組腺病毒的有效性和安全性。

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