臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞nestin mRNA表達(dá)的研究

侯吉鋒，姚星宇，張國(guó)華，趙鵬偉，楊麗敏

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特010059)

研究發(fā)現(xiàn)，臍帶中含有豐富的造血及間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。神經(jīng)巢蛋白(nestin)是一種中等纖維蛋白，在哺乳動(dòng)物神經(jīng)前體細(xì)胞中高表達(dá)，是神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)志分子，目前已有關(guān)于經(jīng)定向誘導(dǎo)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特有抗原或相關(guān)因子的研究報(bào)道［1，2］。為探討未經(jīng)誘導(dǎo)的臍帶MSCs中是否存在神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物基因表達(dá)及其意義，我們于2013年5～12月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院頒發(fā)的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》，經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)前告知對(duì)方實(shí)驗(yàn)方案及風(fēng)險(xiǎn)，產(chǎn)婦家屬簽署自愿捐獻(xiàn)臍帶志愿書后，由婦產(chǎn)科醫(yī)師采集10名健康足月兒的臍帶(產(chǎn)婦均無傳染病)主要試劑及設(shè)備:DMEM/F12(美國(guó)GIBCO)，胎牛血清(美國(guó)GIBCO)，雙抗(青霉素+鏈霉素，美國(guó)GIBCO公司)，臺(tái)盼藍(lán)(Sigma)，PBS(天津化學(xué)試劑廠)，倒置相差顯微鏡(Olympus)，熒光顯微鏡(Nikon)，高速離心機(jī)(RJ-TGL-16B)，層流超凈工作臺(tái)(YJ-1450蘇州凈化設(shè)備廠)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日立)，0.22 μm 微孔濾膜濾器(美國(guó) Millipore)，25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó)Lincoln)。nestin mRNA引物，由TaKaRa公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臍帶MSCs分離、培養(yǎng)及鑒定 取無菌新鮮臍帶標(biāo)本3 cm，以PBS(pH7.4)反洗清洗并沖洗多次，抽掉血管，剪碎臍帶組織，以膠原酶37℃消化2 h，2 500 r/min 離心 10 min，取下層沉淀，以 0.25%胰蛋白酶37℃消化20 min，2 500 r/min離心10 min，取沉淀部分，以PBS吹打使懸浮，100 μm的濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，收集濾過液以2 000 r/min離心10 min，取沉淀部分，以PBS洗滌細(xì)胞3遍，每遍1 000 r/min離心 10 min，以 1×105/L的密度接種于DMEM培養(yǎng)基(培養(yǎng)體系為DMEM/F12+10%胎牛血清+雙抗)中，置于37℃、5%CO2和100%濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3～4 d半量換液1次，細(xì)胞接近80%融合時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞;采用流式細(xì)胞儀鑒定MSCs(MSCs不表達(dá)造血干細(xì)胞的表面特征，而表達(dá) MSCs的標(biāo)志，即CD44、CD90及CD105陽(yáng)性，而 CD34、CD45及 HLA-DR 呈陰性)。傳代培養(yǎng)至第六代細(xì)胞。

1.2.2 臍帶MSCs形態(tài)及活性觀察 細(xì)胞行臺(tái)盼藍(lán)染色倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，活細(xì)胞率 =活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.3 臍帶MSCs nestin mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR法分別檢測(cè)臍帶MSCs原代細(xì)胞及第1代、第2代細(xì)胞的nestin mRNA表達(dá)。引物設(shè)計(jì)與合成:Nestin引物根據(jù)GenBank公布的基因序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)。cDNA提取:取未培養(yǎng)的原代細(xì)胞與培養(yǎng)傳代后的第1代、第2代細(xì)胞各3×105個(gè)作為樣本。根據(jù)TaKaRa公司的Trizol總RNA提取試劑盒提取 RNA。將8 μL的RNA加入反轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA，其中5×Prime-Script RT Master Mix(Perfect Real Time)2 μL，總反應(yīng)體系為10 μL。置入PCR儀中反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件:37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。采用 SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括 SYBR premix Ex TaqⅡ(2 ×)10 μL、PCR Forward Primer 0.8 μL、PCR Reverse Rrimer 0.8 μL、ROX Reference Dye(50 × )or DyeⅡ(50 × )0.4 μL、template 2 μL、蒸餾水 dH2O 6 μL;置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中擴(kuò)增，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸10 s，循環(huán)35次后，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后直接得到結(jié)果，即nestin和管家基因β-actin的ΔCT值，將ΔCT值進(jìn)行運(yùn)算得到均值后，再以nestin的 mean ΔCT 除以管家基因 β-actin 的 meanΔCT，得到的數(shù)值即為此樣本nestin mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 臍帶MSCs形態(tài)及活性 每根臍帶分離到的MSCs為(4.12～6.35)×105個(gè)/L，細(xì)胞活性為96.63%～99.70%。倒置相差顯微鏡觀察，新鮮分離出的MSCs胞體呈圓形，接種約48 h左右，約1/4的細(xì)胞由圓形變?yōu)樗笮?，?xì)胞開始貼壁;72 h后貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈長(zhǎng)梭形，排列緊密;7～8 d后梭形細(xì)胞數(shù)大量增加，細(xì)胞趨向簇狀生長(zhǎng);培養(yǎng)10 d后，可見1～2個(gè)/HP胞體較大、有數(shù)個(gè)放射狀突觸的神經(jīng)樣細(xì)胞，且形態(tài)各不相同，見圖1。培養(yǎng)第30 d(傳代至第5代)，細(xì)胞呈不規(guī)律生長(zhǎng)，無法從形態(tài)判斷。

圖1 培養(yǎng)中成簇狀生長(zhǎng)和放射樣生長(zhǎng)的MSCs

2.2 臍帶MSCs nestin mRNA表達(dá) 見圖2。未培養(yǎng)的原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞nsetin mRNA均呈陽(yáng)性表達(dá)，原代細(xì)胞snestin mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.64±0.42，第1代細(xì)胞為 1.71 ±0.19，第 2 代細(xì)胞為0.26 ±0.06。

圖2 臍帶MSCs nestin mRNA表達(dá)

3 討論

國(guó)內(nèi)外研究表明，臍帶中的MSCs總量高于血、羊水等組織［3～5］，與骨髓血中提取的 MSCs極為相似，同樣具備多向分化的潛能［6～8］，各國(guó)學(xué)者關(guān)于MSCs分化的機(jī)制有許多迥然不同的學(xué)說，至今仍然無統(tǒng)一明確的結(jié)論［9，10］。nestin屬于第Ⅵ型中間絲纖維蛋白，最初被發(fā)現(xiàn)普遍存在于神經(jīng)前體細(xì)胞，在增殖能力強(qiáng)、尚未分化的神經(jīng)前體細(xì)胞中高度表達(dá)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化成熟［11，12］。nestin 在所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞中均有表達(dá)，目前被廣泛作為鑒定中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞的標(biāo)記物，以區(qū)別分化的神經(jīng)細(xì)胞。然而在很多組織中nestin也有表達(dá)，如發(fā)育中的肌肉組織、新形成的內(nèi)皮細(xì)胞、胰腺導(dǎo)管的上皮細(xì)胞、肝臟的星型細(xì)胞等［13］。研究發(fā)現(xiàn)，nestin只在一段特定的時(shí)間段內(nèi)表達(dá)，然后逐漸減少，最后分別被已分化成神經(jīng)元的特異中間纖維和星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)取代［14］。

本研究發(fā)現(xiàn)，臍帶MSCs呈nestin mRNA陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)量在傳代后有明顯減少。但表達(dá)量的減少并不意味著細(xì)胞中神經(jīng)前體細(xì)胞數(shù)量的減少，首先，上述變化特點(diǎn)與nestin蛋白在神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化時(shí)的變化是一致的;其次，這種變化可能與細(xì)胞的橫向分化有關(guān)，有報(bào)道稱干細(xì)胞具有橫向分化特性，造血干細(xì)胞在一定條件下也可橫向分化為神經(jīng)干細(xì)胞［15］，這種不可預(yù)測(cè)的分化趨勢(shì)有可能影響nestin mRNA的表達(dá)。所以，nestin mRNA表達(dá)量的減少可能是上述兩種因素的單一或者共同作用。本研究所用基因序列為nestin mRNA引物，可確定這些nstin mRNA表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞中含有神經(jīng)前體細(xì)胞，但其移植后在活體內(nèi)是否適合作為種子細(xì)胞而發(fā)揮功能還有待于進(jìn)一步研究觀察。

姚星宇等［16］報(bào)道在經(jīng)誘導(dǎo)的臍血單核細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞，我們?cè)谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)，相比較而言，如果是相同數(shù)量的臍帶源細(xì)胞與臍血源細(xì)胞，臍帶中神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)量較臍血更為豐富，可能與臍血中MSCs含量過少有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，臍帶細(xì)胞培養(yǎng)8 d后可見少數(shù)放射狀突起的類似神經(jīng)樣細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)，這些突起的形態(tài)類似于軸突、樹突，傳代后仍有類似細(xì)胞的出現(xiàn)，但是在傳代5次以后，大部分細(xì)胞呈上皮樣生長(zhǎng)或者不規(guī)則形態(tài)生長(zhǎng)，很難再找到神經(jīng)樣細(xì)胞，這些神經(jīng)樣細(xì)胞除了有放射狀突起外，形態(tài)各不相同，表明部分MSCs可成長(zhǎng)為神經(jīng)樣細(xì)胞，不排除MSCs自發(fā)分化為神經(jīng)前體細(xì)胞的可能，但這些神經(jīng)樣細(xì)胞移植后是否能發(fā)揮神經(jīng)元的功能并不可知。

綜上所述，新鮮的臍帶組織分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞有nestin mRNA表達(dá)，且傳代后該基因仍有表達(dá)，提示其存在分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能;盡管傳代后表達(dá)量有所減少，但仍可作為穩(wěn)定可靠的細(xì)胞供體;同時(shí)發(fā)現(xiàn)部分MSCs培養(yǎng)時(shí)可能出現(xiàn)形態(tài)各異的類神經(jīng)樣細(xì)胞，說明臍帶MSCs中可能存在神經(jīng)前體細(xì)胞，其有可能成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾患的種子細(xì)胞之一。目前干細(xì)胞移植仍有許多不成熟及疑惑之處，首先，未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs中神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)量極少，不能達(dá)到治療目的;其次，植入體內(nèi)的干細(xì)胞中nestin基因表達(dá)是否會(huì)被抑制尚不可知，需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

［1］吳永超，鄭啟新，謝宗平，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)生長(zhǎng)因子和治療脊髓損傷的研究［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2005，22(2):139-141.

［2］王軍，范亞珍，陳海，等.臍血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞中Foxg1和Nestin基因的表達(dá)及其相互關(guān)系［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2010，25(11):848-850.

［3］Lee JW，F(xiàn)ang X，Krasnodembskaya A，et al.Concise review:Mesenchymal stem cells for acute lung injury:role of paracrine soluble factors［J］.Stem Cells，2011，29(6):913-919.

［4］吳祖澤，賀福初，裴雪濤.造血調(diào)控［M］.上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社，2000:245.

［5］Kestendjieva S，Kyurkchiev D，Tsvetkova G，et al.Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord［J］.Cell Biol Int，2008，32(7):724-732.

［6］Sarugaser R，Lickorish D，Baksh D，et al.Human umbilical cord perivascular(HUCPV)cells:a source of mesenchymal progenitors［J］.Stem Cells，2005，23(2):220-229.

［7］Dezawa M，Kanno H，Hoshino M，et al.Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation［J］.J Clin Invest，2004，113(12):1701-1710.

［8］齊凱，董麗媛，陳顯久.人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的優(yōu)化［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(23):4220-4224.

［9］Dennis JE，Charbord P.Origin and differentiation of human and murine stroma［J］.Stem Cells，2002，20(3):205-214.

［10］Volarevic V，Arsenijevic N，Lukic ML，et al.Concise review:Mesenchymal stem cell treatment of the complications of diabetes mellitus［J］.Stem Cells，2011 ，29(1):5-10.

［11］Suzuki S，Namiki J，Shibata S，et al.The neural stem/progenitor cell markernestin is expressed in proliferative endothelial cells，but not in mature vasculature［J］.J Histochem Cytochem，2010，58(8):721-730.

［12］冶娟，慕曉玲.人臍帶、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞中“干”性蛋白表達(dá)的研究［J］.生物醫(yī)學(xué)工程研究，2011，30(4):220-225.

［13］Mokry J，Pudil R，Ehrmann J，et al.Re-expression of nestin in the myocandium of postinfarcted patients［J］.VInchows Arch，2008，453(1):33-41.

［14］Lendahl U，Zimmerman LB，McKay RD.CNS stem cells ex-press a new class of intermediate filament protein［J］.Cell，1990，60(4):585-595.

［15］Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop DJ，et al.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons［J］.J Neuro Res，2000，61(4):364.

［16］姚星宇，張國(guó)華，楊麗敏.臍血干細(xì)胞中神經(jīng)樣細(xì)胞的研究［J］.臨床神經(jīng)病學(xué)，2013，26(1):41-43.