當歸芍藥散對代謝性炎性反應小鼠血脂和血清炎性反應因子IL-6、MCP-1 及 NF-κB、PPARγmRNA 表達的影響

賈麗超 周明學 張 蕾 劉衛(wèi)紅

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京市中醫(yī)研究所，北京100010)

代謝性炎性反應(metaflammation)是一種低度慢性的系統(tǒng)性炎性反應［1］。新近研究［2］發(fā)現，肥胖、糖尿病、脂肪肝、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)等代謝相關疾病都存在慢性低水平炎性反應。其中，AS與代謝性炎性反應關系更為密切。研究［1-3］已證實，AS是一種多細胞及炎性細胞因子參與的慢性炎性疾病。有研究者［2］認為，AS的早期主要病機以痰淤互結為主，治療通常以活血化痰為主要治法。當歸芍藥散是活血化痰的代表方劑，由當歸、芍藥、茯苓、白術、澤瀉、川芎6味中藥組成，研究［3-6］表明當歸芍藥散具有明顯的調血脂和改善臨床證候的作用。為此，本研究采用高脂飲食聯合脂多糖注射造成小鼠代謝性炎性反應模型，研究當歸芍藥散對早期As代謝性炎性反應小鼠的血脂和炎性反應的影響。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性C57小鼠，60只，體質量18～20 g，8周齡，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物合格證號:SCXK(京)2012-0001。

1.2 試劑

脂多糖，購于美國Sigma公司。膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒(批號 100301)、三酰甘油(triglyceride，TG)試劑盒(批號100301)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein，HDL-C)試劑盒(批號091201)，低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein，LDL-C)試劑盒(批號091201)均購于英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司。炎性反應因子(IL-6)試劑盒(批號558301)、炎性反應因子(MCP-1)試劑盒(批號558342)均購于北京利文商貿有限責任公司。

1.3 儀器

流式細胞儀BD FACSVerseTM，美國BD公司生產。

1.4 藥物

當歸芍藥散(當歸30 g、赤藥160 g、茯苓40 g、白術40 g、澤瀉80 g、川芎30 g)。中藥飲片由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，由北京中醫(yī)醫(yī)院制劑中心制備散劑。立普妥為輝瑞制藥有限公司生產，批號為H20051408。

1.5 動物模型的建立與分組

將60只雄性C57小鼠在SPF級動物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)，實驗分為正常組(n=15)、模型組(n=15)、立普妥組(n=15)、當歸芍藥散組(n=15)。除正常組外，其余各組小鼠均喂飼高脂飼料(高脂飼料配方:73.3%基礎飼料、10%豬油、10%蛋黃粉、1.5%膽固醇、0.2%膽汁酸、5%蔗糖購于北京萬德銳志生物有限公司)，和腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(1 mg/kg)，LPS 每周注射1 次。于造模5周后，開始灌胃給藥，每天2次，連續(xù)灌胃5周。給藥組小鼠灌胃量按成人臨床等效劑量換算成小鼠劑量，當歸芍藥散2.2 g/kg，立普妥0.003 g/kg。正常對照組和模型組灌服等體積蒸餾水。

1.6 主動脈病理學檢測

末次給藥后，禁食12 h，麻醉，解剖動物，取出主動脈，用10%的甲醛固定，每組取9只，隨后進行石蠟切片及常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察主動脈組織病理學改變。使用Image Proplus 6.0測量管壁內中膜厚度(intima-media thickness，μm)。

1.7 血脂測定

末次給藥后，禁食12 h，眶下靜脈叢取血，離心后分離血清，分別采用總膽固醇檢測試劑盒(CHODPOD法)測定血清TC寫濃度，三酰甘油測定試劑(縮寫GPO-POD法)測定TG濃度和直接法測定HDL-C和LDL-C濃度。

1.8 血清炎性反應因子濃度測定

采用流式細胞術檢測小鼠血清中炎性反應因子濃度。取連續(xù)倍比稀釋的標準品和待測樣品(樣品量為50 μL)，按照試劑盒說明書完成樣品孵育步驟并對流式細胞儀進行設置，然后用流式細胞儀和BDCBA軟件獲取數據并分析。具體方法參照文獻［7］。

1.9 反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)

末次給藥后，禁食12 h，麻醉，解剖動物，取出肝臟，放入液氮中，后轉入-80℃保存，用于檢測。

1)肝臟組織總RNA的提取:用超純RNA提取試劑盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581)提取肝臟組織樣本中總RNA。電泳分析總 RNA完整性并檢測 RNA的純度和含量，選用吸光度A260/吸光度A280比值為118～210的RNA用作反轉錄。

2)反轉錄制備模板CDNA:將RNA模板、引物、5×RT Buffer和無RNase水溶解并置于冰上備用。向反應管中加入20 μL 反應體系的第一部分，Primer mix，2 μL，消化后 RNA，10 μL，65 ℃孵育5 min，迅速冰浴2 min，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。繼續(xù)向以上反應管中加入以下試劑:5 ×RT Buffer 4 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，10 mmol/L dNTP Each 1 μL，HiFi-MMLV Enzyme Mix 1 μL，輕輕吸打混勻，37 ℃ 孵育 50 min，70 ℃ 保溫 10 min。反應結束后的cDNA放置-20℃保存。

3)目的基因的PCR擴增:NF-κB上下游引物序列:上游:5’-CAATGGCTACACAGGACCAGGAACA-3，下游:5’-GGATTCGCTGGCTAATGGCTTGCTC-3’，擴增產物長度為215 bp。

內參-actin基因PCR引物:上游:5’-GCCTTCCTTCTTGGGTAT-3’，下 游:5’-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3’，擴增產物長度為97 bp。

PPARγ 上 下 游 引 物 序 列:上 游:5’-TTTCAAGGGTGCCAGTTTCG-3’，擴增產物長度 196 bp，下游:5’-ATCCTTGGCCCTCTGAGATGAG-3’，擴增產物長度196 bp。內參基因PCR引物:上游:5’-GCCTTCCTTCTTGGGTAT-3’，下 游:5’-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3’，擴增產物長度為97 bp。

擴增程序為:95℃ 10 min，(95℃ 15 s，60℃ 60 s)×45個循環(huán)。Real time反應體系為:2×UltraSYBR Mixture:10 μL，上游引物(10 μmol/L):0.4 μL，下游引物(10 μmol/L):0.4 μL，模板:2 μL。加入滅菌蒸餾水至 20 μL。

4)PCR產物分析:取5 μL RNA，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)進行灰度掃描并拍攝打印實驗結果，用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Gel2 Pro Analyzer Version 310)分析結果，并以β-actin校正作相對量分析，數值以兩者之間吸光度的比值表示。

1.1 0 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學處理，計量數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析方法和均數兩兩比較LSD方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 造模結果

與正常組小鼠相比，模型組小鼠出現了脂代謝紊亂和炎性反應因子濃度的提高(圖1、2)，因此建模成功。

2.2 當歸芍藥散對代謝性炎性反應小鼠主動脈病理改變的影響

與正常組小鼠相比，模型組小鼠主動脈出現內膜增厚和炎性反應細胞的聚集，與模型組小鼠相比，當歸芍藥散組小鼠主動脈內膜變薄，炎性反應細胞聚集減少。Image Proplus 6.0測量管壁內中膜厚度，模型組明顯增厚(P＜0.05)，當歸芍藥散組增厚明顯減少(P＜0.05)。

圖1 當歸芍藥散對代謝性炎性反應小鼠主動脈病理改變的影響Fig.1 Effect of Dangguishaoyaosan on the aortic pathological changes of the metaflammatory mice(HE dyed 400×，n=9)

2.3 當歸芍藥散對代謝性炎性反應小鼠血脂的影響

與正常組小鼠血清血脂相比，模型組小鼠血清TC、TG和LDL-C濃度均明顯升高(P＜0.01)，與模型組小鼠血清血脂相比，當歸芍藥散組小鼠血清TC、TG和LDL-C濃度降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.4 當歸芍藥散對代謝性炎性反應小鼠血清炎性反應因子IL-6和MCP-1濃度的影響

與正常組小鼠血清炎性反應因子水平相比，模型組小鼠血清IL-6和MCP-1水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，與模型組小鼠血清炎性反應因子水平相比，當歸芍藥散組小鼠血清IL-6和MCP-1濃度降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖2 當歸芍藥散對小鼠血脂水平的影響Fig.2 Effect of Dangguishaoyaosan on the blood lipids of the mice(±s)

圖3 當歸芍藥散對小鼠血清炎性反應因子IL-6和MCP-1濃度的影響Fig.3 Effect of Dangguishaoyaosan on the expression of inflammatory factors，such as IL-6，MCP-1，of the mice(±s)

2.5 當歸芍藥散對小鼠肝臟NF-κB、PPARγmRNA的表達影響

與正常組小鼠相比，模型組小鼠肝臟NF-κB mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與模型組小鼠相比，當歸芍藥散組小鼠肝臟NF-κB mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖4 當歸芍藥散對小鼠肝臟NF-κB mRNA濃度的影響Fig.4 Effect of Dangguishaoyaosan on the expression of NF-κB mRNA of the mice(±s)

與正常組小鼠相比，模型組小鼠肝臟PPARγ mRNA降低(P＜0.05)差異有統(tǒng)計學意義，與模型組小鼠相比，當歸芍藥散組小鼠肝臟PPARγ mRNA提高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖5 當歸芍藥散對小鼠肝臟PPARγ mRNA的影響Fig.5 Effect of Dangguishaoyaosan on the expression of PPARγ mRNA of the mice(±s)

3 討論

代謝性炎性反應是由攝入營養(yǎng)物和代謝過剩觸發(fā)的炎性反應過程，是一種低程度、慢性的系統(tǒng)性炎性反應。研究［8］證實，AS是一種多細胞及炎性細胞因子參與的慢性炎性疾病，并且炎性反應參與AS的全過程。在AS的發(fā)展過程中，都有各種炎性反應因子及細胞的參與。其中主要的炎性反應通路就是核因子 κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)，激活后可促進促炎細胞因子、黏附分子、趨化因子、生長因子以及環(huán)氧合酶2和誘導型一氧化氮合酶等氧化應激相關酶基因的過度表達，引起明顯的炎性反應，進而可以誘導AS的發(fā)生?；罨倪^氧化物酶體增生物激活受體 γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)通過多種信號通路，可以抑制AS促炎因子表達，減輕免疫和炎性反應，抑制單核細胞/巨噬細胞向泡沫細胞轉化等，調節(jié)炎性反應，從而延緩AS發(fā)展。PPARγ已成為抗AS新藥開發(fā)的新靶點。

目前有多種化學物質及微生物(病毒和細菌)可制作慢性炎性反應模型，常用的有酪蛋白皮下注射制作慢性炎性反應模型［9-11］和小劑量腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)制作慢性炎性反應模型，本實驗中采取了高脂聯合LPS來制備小鼠代謝性炎性反應模型，模型小鼠出現了脂代謝紊亂和炎性因子濃度的提高，與既往的研究［12］相符合，成功復制了小鼠代謝性炎性反應模型。而腸道是人體最大的細菌和LPS庫，腸道菌群的改變增大了腸壁的通透性，使得血液中內毒素濃度升高，促進炎性反應細胞因子的產生，說明代謝性炎性反應的形成很可能與腸道菌群失調有關。

高脂血癥和動脈粥樣硬化早期以痰濕為主要病機，隨著病情進展出現血瘀證候，由痰致淤，痰淤互結，痰濁貫穿病程始終。本課題組既往研究［13］也證實高脂血癥和動脈粥樣硬化存在由痰致淤的病理演變，以痰淤互結為主要病機，因此本實驗采用了化痰活血的當歸芍藥散來治療高脂血癥及動脈粥樣硬化，以起到痰淤同治的效果。有研究［14］發(fā)現當歸芍藥散對炎性疾病具有一定的療效。本研究結果表明當歸芍藥散減低了小鼠的血脂濃度。PPARγ配體或激動劑通過降低TG和LDL-C濃度來調節(jié)脂代謝紊亂［15］。

本實驗結果表明當歸芍藥散可以顯著降低代謝性炎性反應小鼠血脂和炎性反應因子IL-6和MCP-1濃度，且顯著降低了 NF-κB mRNA表達并提高了PPARγ mRNA的表達水平。表明當歸芍藥散可能通過抑制NF-κB的活化從而減少了炎性反應因子IL-6、MCP-1的表達以抑制炎性反應。同時當歸芍藥散提高了PPARγ mRNA表達，PPARγ配體或激動劑通過降低TG和LDL-C濃度來調節(jié)脂代謝紊亂，通過抑制NF-κB的活化，減少炎性反應因子IL-6、MCP-1的表達，從而抑制炎性反應。本研究表明當歸芍藥散可通過調節(jié)代謝性炎性反應治療早期動脈粥樣硬化，為當歸芍藥散治療動脈粥樣硬化的臨床應用提供了實驗依據。

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