局部血管內(nèi)低劑量促紅細(xì)胞生成素和聯(lián)合tPA注射對(duì)大鼠腦缺血的影響

王榮亮 趙海蘋 武曉寧 高金環(huán) 吉訓(xùn)明 羅玉敏

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京100053)

重組組織纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，tPA)用于急性缺血性卒中的治療已經(jīng)持續(xù)很多年，但其治療時(shí)間窗較短，有腦出血等嚴(yán)重合并癥，使其在臨床使用上受到嚴(yán)格的限制［1-2］。因此，延長(zhǎng)tPA的治療時(shí)間窗和減少其引發(fā)腦出血的不良反應(yīng)，擴(kuò)展tPA在臨床的應(yīng)用范圍是目前研究的重點(diǎn)。

基礎(chǔ)研究及臨床研究［3-5］表明，重組人類促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)對(duì)缺血性卒中患者有較好的治療效果。然而，rhEPO很難通過血腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)，需要大劑量、多次注射才能達(dá)到治療效果，但這種方式可因其促紅細(xì)胞生成的活性而產(chǎn)生多種不良反應(yīng)。本課題組之前的研究［6］表明，在rhEPO中增加一個(gè)艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)來源的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域TAT，在不影響其生物活性的前提下，可以顯著地增加rhEPO跨越BBB的能力，為減少rhEPO的治療劑量提供了新的思路，但通過這種方法構(gòu)建的融合蛋白(EPO-TAT)在臨床應(yīng)用中的安全性還有待進(jìn)一步研究。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血-再灌注后，通過大腦中動(dòng)脈局部血管內(nèi)注射低劑量EPO，可以起到良好的神經(jīng)保護(hù)作用［7］，對(duì)于卒中患者是一種潛在的治療策略。

研究［8-10］證實(shí)，高劑量注射 EPO(2 500～5 000 IU/kg)聯(lián)合tPA同時(shí)注射，在大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)后表現(xiàn)出很嚴(yán)重的不良反應(yīng)，例如血腦脊液屏障通透性增加、腦出血及死亡。本研究認(rèn)為這些不良反應(yīng)與注射EPO的起始時(shí)間、劑量和注射方式有關(guān)。因此，本文主要研究通過大腦中動(dòng)脈局部血管內(nèi)低劑量EPO聯(lián)合tPA注射，是否可以減少tPA單獨(dú)使用的不良反應(yīng)及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)材料

成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量280～320 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2008-0001〕。實(shí)驗(yàn)所使用的所有動(dòng)物均經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。恒溫條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前一晚禁食但不禁水。所有化學(xué)試劑購買于美國Sigma公司。rhEPO購于沈陽陽光藥業(yè)股份有限公司(沈陽，中國)。實(shí)驗(yàn)前采用數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組10只:(1)假手術(shù)組;(2)［tPA+NS］2 h組;(3)［tPA+NS］4 h組;(4)［tPA+EPO］2 h組;(5)［tPA+EPO］4 h組。NS代表0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，2 h和4 h代表腦缺血時(shí)間。

1.2 大鼠腦缺血模型的制作

大鼠腦缺血模型采用血管內(nèi)線栓模型［11］，大鼠稱體質(zhì)量后用4%恩氟烷誘導(dǎo)麻醉，應(yīng)用小動(dòng)物呼吸機(jī)及麻醉機(jī)，1% ～2%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷混合70%(體積分?jǐn)?shù))N2O和30%(體積分?jǐn)?shù))O2維持麻醉，術(shù)中監(jiān)測(cè)肛溫、血糖、血?dú)饧把獕海瑢⒏黜?xiàng)指標(biāo)維持在正常范圍。選擇右側(cè)大腦中動(dòng)脈，所應(yīng)用的線栓(北京沙東生物技術(shù)有限公司)頭部直徑為0.38 mm，將其插入頸內(nèi)動(dòng)脈，至距頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈分叉處約1.8～1.9 cm，感覺有明顯阻力后停止。假手術(shù)組分離血管，但不插栓。在大鼠腦缺血2 h或4 h后，抽出線栓，大鼠腦血流再灌注。用激光多普勒(Laser Doppler flowmetry，LDF)監(jiān)測(cè)整個(gè)手術(shù)過程中大鼠腦血流變化情況，以驗(yàn)證線栓阻斷成功。再灌注即刻，通過尾靜脈注射的方式在30 min內(nèi)給予tPA(10 mg/mL)和0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(［tPA+NS］2 h、［tPA+NS］4 h)，或通過大腦中動(dòng)脈注射的方式按照800 IU/kg的劑量在4 min內(nèi)給予EPO(［tPA+EPO］2 h、［tPA+EPO］4 h)。在手術(shù)過程中，通過溫控墊將大鼠肛溫維持在(37.0±0.5)℃。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中記錄大鼠的死亡數(shù)量。

1.3 腦梗死體積

大鼠腦缺血-再灌注24 h后，取腦組織并切片，用蒸餾水配制的1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色，計(jì)算腦梗死體積及水腫體積。對(duì)缺血側(cè)腦切片的出血點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組累積計(jì)算40個(gè)腦切片。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分

在大鼠腦缺血-再灌注24 h后行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)，采用 Ludmila Belayev 12 分評(píng)分法［12］:(1)姿勢(shì)反射試驗(yàn)，即提尾懸空試驗(yàn):無明顯神經(jīng)功能缺失為0分，梗死對(duì)側(cè)肢體屈曲為1分，側(cè)推試驗(yàn)陽性為2分。(2)肢體放置試驗(yàn):① 視覺亞實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)者將動(dòng)物握于手中，使其前爪懸空，讓動(dòng)物位于桌子前方，自桌面上方10 cm處向桌面緩慢斜線靠近，大鼠正常反應(yīng)為前肢即抓向桌面，損傷大鼠則表現(xiàn)為肢體反應(yīng)延遲。0分:動(dòng)物肢體放置反應(yīng)正常;1分:反應(yīng)延遲但不超過2 s;2分:反應(yīng)延遲且超過2 s。側(cè)方刺激，讓動(dòng)物位于桌子側(cè)方，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)同前方刺激。②觸覺亞實(shí)驗(yàn)，將動(dòng)物雙眼遮住，并使其前爪懸空，用其前爪背側(cè)輕觸桌面，刺激深度僅達(dá)皮膚和毛發(fā)，動(dòng)物反應(yīng)及評(píng)分同視覺亞試驗(yàn)，觸覺刺激同樣分前方和側(cè)方刺激。③ 本體覺亞實(shí)驗(yàn)，操作及評(píng)分同觸覺亞實(shí)驗(yàn)，僅刺激深度不同，本體覺亞實(shí)驗(yàn)給予前爪較大壓力，刺激深達(dá)肌肉及關(guān)節(jié)。該亞實(shí)驗(yàn)只有前方刺激。動(dòng)物前肢放置試驗(yàn)總分范圍為0～10分，功能損傷越重，得分越高。

1.5 血常規(guī)檢測(cè)

在大鼠腦缺血4 h再灌注24 h后，從腹主動(dòng)脈取血液樣本。在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行血常規(guī)的檢測(cè)。包括白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)，檢測(cè)血紅蛋白濃度。

1.6 免疫印跡法檢測(cè)

大鼠腦缺血-再灌注24 h后，用過量水合氯醛麻醉處死，取梗死側(cè)皮質(zhì)腦組織稱質(zhì)量，加入5倍體積的裂解液，裂解液成分包含20 mmol/L Tis-HCl(pH 7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L EGTA，1%NP-40，2.5 mmol/L 焦磷酸鈉，1 mmol/L β-甘油磷酸酯，1 mmol/L Na3VO4和 1 μg/mL 亮抑蛋白酶肽。將組織超聲破碎后，蛋白定量，隨后進(jìn)行常規(guī)的免疫印跡檢測(cè)。電泳、電轉(zhuǎn)后，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h;按照1∶1 000的比例加入p-AKT(Ser473)、p-ERK(Thr202/Tyr204)(Cell Signaling Technology，美國)一抗，4℃孵育過夜;按照1∶5 000的比例加入HRP標(biāo)記的二抗(Abgent公司，美國)，室溫孵育1 h后，利用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果用Quantity one 4.4.0軟件分析蛋白條帶的相對(duì)灰度。

1.7 免疫熒光染色

大鼠腦缺血-再灌注24 h后，腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛磷酸鹽溶液經(jīng)右心室快速灌注，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中后固定48 h，石蠟包埋、進(jìn)行腦冠狀切片，每片厚約5 μm。用0.3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2/甲醇溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，EDTA抗原微波熱修復(fù)，用3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))小牛血清磷酸鹽溶液封閉2 h;按照1∶50的比例加p-AKT(Ser473)、p-ERK(Thr202/Tyr204)抗體，4℃孵育過夜;加入TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG熒光二抗，室溫孵育30 min;DAPI封片，熒光顯微鏡下觀察并記錄。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組之間的比較采用Student’s t-test;多組之間的分析比較采用 one-way ANOVA 及post-hoc Scheffe’s test方法，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPO聯(lián)合tPA使用可以減小大鼠腦梗死體積，改善神經(jīng)功能評(píng)分

大鼠腦缺血再灌注24 h后，TTC染色計(jì)算腦梗死體積百分比(圖 1A)。結(jié)果顯示，與［tPA+NS］4 h組相比，［tPA+EPO］4 h組梗死百分比顯著減少(P＜0.05，圖1B);［tPA+EPO］2 h組與［tPA+NS］2 h組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，［tPA+EPO］4 h組大鼠神經(jīng)功能損傷明顯低于［tPA+NS］4 h組(P＜0.05，圖1C)。［tPA+EPO］2 h組與［tPA+NS］2 h組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C)。

圖1 腦梗死體積及神經(jīng)功能的結(jié)果Fig.1 Results of cerebral infarction volume and neurological function

A:representative results of TTC staining;B:cerebral infarction volumes were analyzed and calculated;C:representative results of neurological function.*P＜0.05 vs tPA+NS group，n=6;tPA:tissue plasminogen activator;EPO:erythropoietin;NS:normal saline;TTC:2，3，5-triphenyltetrazolium chloride.

2.2 EPO聯(lián)合tPA使用可以減少病死率、腦水腫和腦出血

在本研究中，［tPA+EPO］2 h組和［tPA+EPO］4 h組的病死率分別是10%和20%，明顯低于［tPA+NS］2 h組(30%，P＜0.05)和［tPA+NS］4 h組(60%，P ＜0.05)。通過TTC染色計(jì)算腦水腫顯示(圖1A):［tPA+EPO］2 h組和［tPA+EPO］4 h組的腦水腫百分比分別低于［tPA+NS］2 h組和［tPA+NS］4 h組(P＜0.05，圖2B)。同樣，通過對(duì)每組40個(gè)腦切片出血點(diǎn)的觀察和計(jì)數(shù)表明，［tPA+EPO］2 h組和［tPA+EPO］4 h組的出血點(diǎn)數(shù)量分別低于［tPA+NS］2 h組和［tPA+NS］4 h組(P＜0.05，圖2C)。這些結(jié)果顯示，通過大腦中動(dòng)脈低劑量注射EPO聯(lián)合tPA使用后，降低了 大鼠的病死率、血腦脊液屏障通透性和腦出血。

圖2 病死率、腦水腫和腦出血的結(jié)果Fig.2 Results of mortality，brain edema and hemorrhage

2.3 EPO聯(lián)合tPA注射不影響紅細(xì)胞及血紅蛋白變化

圖3 血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Results of routine blood tests

本研究通過降低EPO的使用劑量避免對(duì)紅細(xì)胞及血紅蛋白的影響等不良反應(yīng)的發(fā)生。應(yīng)用腦缺血4 h，再灌注24 h后的大鼠進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)來驗(yàn)證。［tPA+EPO］4 h組和［tPA+NS］4 h組大鼠的白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞(圖3A)、紅細(xì)胞(圖3B)的總數(shù)、血紅蛋白濃度(圖3C)和血小板數(shù)量(圖3D)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)了用低劑量EPO聯(lián)合tPA治療，不會(huì)產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)。

2.4 EPO聯(lián)合tPA使用可以增加大鼠腦皮質(zhì)中p-AKT的表達(dá)

圖4 p-AKT的蛋白免疫印跡及免疫熒光結(jié)果Fig.4 Results of western blotting and immunofluorescence for p-Akt

本研究通過Western blotting和免疫熒光的方法檢測(cè)了大鼠腦皮質(zhì)p-AKT的濃度。如圖4A所示，相對(duì)于Sham 組，［tPA+EPO］2 h組和［tPA+NS］2 h組大鼠腦皮質(zhì)中的p-AKT濃度顯著增加，但兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，［tPA+EPO］4 h組p-AKT濃度明顯高于［tPA+NS］4 h組(P＜0.05)，提示大鼠腦缺血4 h后，通過EPO處理激活了AKT通路。免疫熒光顯示，與sham組和［tPA+NS］4 h組(圖4B)相比，［tPA+EPO］4 h組大鼠腦皮質(zhì)中p-AKT陽性的神經(jīng)元明顯增加，這一結(jié)果與Western blotting的結(jié)果相符合。

2.5 EPO聯(lián)合tPA使用可以增加大鼠腦皮質(zhì)中p-ERK的表達(dá)

Western blotting結(jié)果表明，與 sham組相比較，［tPA+NS］2 h組、［tPA+EPO］2 h組和［tPA+NS］4 h組的p-ERK濃度無明顯變化;與sham組和［tPA+NS］4 h組相比較，［tPA+EPO］4 h組大鼠腦皮質(zhì)中p-ERK的濃度顯著增加(P＜0.05，圖5A)。與Western blotting結(jié)果一致，相對(duì)于［tPA+NS］4 h組，［tPA+EPO］4 h組大鼠腦皮質(zhì)中p-ERK陽性的神經(jīng)元明顯增加(圖5B)。

圖5 p-ERK的蛋白免疫印跡及免疫熒光結(jié)果Fig.5 Results of western blotting and immunofluorescence for p-ERK

3 討論

在缺血性卒中治療中，雖然很多基礎(chǔ)研究［3-5］和臨床研究［8，13］已經(jīng)證明EPO具有治療腦缺血的潛力，但是當(dāng)大劑量EPO聯(lián)合tPA使用時(shí)會(huì)引發(fā)有害的不良反應(yīng)，如紅細(xì)胞增多、增加血栓形成，這些可以使腦缺血損傷更加惡化［8-10，14］。2008年，德國哥廷根大學(xué)開展了多中心EPO卒中臨床Ⅲ期試驗(yàn)［8］，用EPO(單次靜脈注射40 000 IU)治療急性腦缺血患者后，很多患者出現(xiàn)腦出血和死亡，其中63%的患者接受過tPA溶栓治療。研究［8］表明，EPO不適用于治療tPA溶栓后的腦卒中患者。但是，該臨床試驗(yàn)中存在幾個(gè)問題:① 約50%患者進(jìn)行tPA溶栓時(shí)超過了規(guī)定的時(shí)間窗;②EPO注射的劑量過大(單次靜脈注射40 000 IU)。這些很有可能是EPO聯(lián)合tPA使用后導(dǎo)致患者的腦出血和高病死率的關(guān)鍵問題，也是很多基礎(chǔ)研究與臨床試驗(yàn)結(jié)果不相符的原因。Jia等［9］通過建立大鼠MCAO模型，發(fā)現(xiàn)在大鼠腦缺血6 h后，當(dāng)rhEPO(5 000 IU/kg)聯(lián)合tPA(10 mg/kg)使用時(shí)沒有減少腦梗死體積，而且rhEPO會(huì)加劇tPA誘發(fā)的腦出血。值得注意的是，與對(duì)照組相比，在腦缺血后2 h給予rhEPO聯(lián)合tPA治療可以顯著減少腦梗死體積，并且沒有顯著的增加腦出血轉(zhuǎn)化。這與本試驗(yàn)中的腦缺血4 h結(jié)果相符。在線栓制作的大鼠腦缺血模型中，tPA的治療時(shí)間窗不超過腦缺血后的4 h，延遲給予tPA治療會(huì)增加腦出血性轉(zhuǎn)化［15-16］。因此，Jia等［9］研究中的大鼠腦缺血6 h后給藥產(chǎn)生的不良反應(yīng)，可能與tPA超過治療時(shí)間窗有關(guān)，與該研究結(jié)果不同的是，本研究顯示，在大鼠腦缺血后2 h給予治療并未減少腦梗死體積，有待進(jìn)一步的研究。但證實(shí)了腦缺血4 h后，同時(shí)使用EPO及tPA是可行的，沒有增加出血性轉(zhuǎn)化或其他不良反應(yīng)。以上這些研究結(jié)果提示，明確EPO和tPA之間的作用關(guān)系、確定給藥時(shí)間、方式和劑量在治療缺血性卒中過程中非常必要。

在本研究中，為了避免高劑量注射EPO產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成的不良反應(yīng)，同時(shí)又能有效的達(dá)到治療作用。本研究采用了低劑量EPO(800 IU/kg)聯(lián)合tPA通過大腦中動(dòng)脈注射的給藥方式。結(jié)果顯示，相對(duì)于單獨(dú)使用tPA(tPA+NS組)，在大鼠腦缺血4h后，通過大腦中動(dòng)脈聯(lián)合注射tPA及EPO，可以顯著減少腦缺血后梗死體積、神經(jīng)功能缺失、病死率、腦水腫和腦出血點(diǎn)，提示EPO發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的同時(shí)并未加劇tPA誘發(fā)的腦出血。此外，tPA+NS組和tPA+EPO組大鼠的白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞的總數(shù)、血紅蛋白濃度和血小板數(shù)量無明顯變化，提示該劑量的EPO(800 IU/kg)聯(lián)合tPA是治療腦缺血-再灌注損傷中一個(gè)安全、有效的策略。

研究［17-18］表明，ERK通路是腦缺血后重要的生存通路。在腎損傷［19］和心肌癥［20］中，EPO 主要通過激活A(yù)KT通路起到保護(hù)性作用，當(dāng)AKT通路被抑制后，ERK通路被激活，參與保護(hù)作用［21］。另一方面，也有些研究［22-24］認(rèn)為，EPO治療腦缺血性損傷時(shí)，兩條通路同時(shí)被激活。關(guān)于EPO起效的信號(hào)通路的矛盾可能是因?yàn)榻M織和器官的差異性［25-27］。本研究證實(shí)，相對(duì)于［tPA+NS］4 h組，［tPA+EPO］4 h組大鼠 p-ERK和p-AKT的水平顯著增加，表明兩條通路均參與了EPO的治療過程。

綜上所述，在大鼠腦缺血-再灌注后，通過大腦中動(dòng)脈低劑量注射EPO后可以起到神經(jīng)保護(hù)的效果，并未引發(fā)tPA的不良反應(yīng)，這可能為今后腦缺血性中風(fēng)治療提供了新策略。本研究目前認(rèn)為，大腦中動(dòng)脈低劑量注射EPO可能是通過激活A(yù)KT和ERK通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步明確。

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