人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為肝臟樣細(xì)胞的試驗(yàn)研究

張?jiān)莆?徐麗娟 王淑芳 閻 麗*

(1.解放軍總醫(yī)院南樓臨床部消化內(nèi)科，北京100853;2.解放軍總醫(yī)院輸血科干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，北京100853)

我國(guó)是一個(gè)乙型肝炎大國(guó)，肝炎病毒攜帶率高達(dá)10%［1］;隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活方式的改變，大量飲酒所致的酒精性肝病呈逐年上升趨勢(shì);近年來(lái)保健、減肥藥物的使用以及藥物的濫用，藥物性肝病逐年上升;隨著環(huán)境污染的加重，自身免疫性肝病、遺傳性肝病也呈逐年上升趨勢(shì)。這些數(shù)目巨大的肝病患者，在經(jīng)歷一定時(shí)間后絕大部分將會(huì)發(fā)展成為慢性肝病，甚至肝硬化。常規(guī)的內(nèi)科治療雖能改善其臨床癥狀，卻不能逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞數(shù)量日益減少所導(dǎo)致的肝功能的逐漸減退。目前，原位肝移植(orthotropic liver transplantation，OLT)是治療該病最有效手段，但由于存在供肝缺乏、免疫排斥、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、費(fèi)用昂貴等諸多因素，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用［2］。干細(xì)胞在再生領(lǐng)域所取得的巨大進(jìn)展為慢性肝病的治療提供了新的視角。

干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞，廣泛分布于骨髓［3］、肌肉［4］、臍帶血［5］、外周血［6］、脂肪［7-12］等器官和組織中，能跨胚層分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。Zuk等［13-14］的研究證明人的脂肪組織中含有間充質(zhì)干細(xì)胞，將其稱為人脂肪來(lái)源的干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hADSCs)，根據(jù)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志、基因表達(dá)以及多向分化潛能，表明該細(xì)胞具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的生物特性［14-16］。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有取材方便，患者痛苦小，體外擴(kuò)增迅速等優(yōu)點(diǎn)，而且在細(xì)胞治療的應(yīng)用上，在含量［13］及分化能力［17-19］上較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有一定的優(yōu)勢(shì)。2005年，Seo等［20］報(bào)道脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在相關(guān)生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子的作用下，于體外能被誘導(dǎo)為具有白蛋白合成功能及分泌尿素功能的肝臟樣細(xì)胞。這預(yù)示著，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞有望成為肝病細(xì)胞治療理想的種子細(xì)胞。

本課題通過(guò)膠原酶消化離心法從脂肪組織中獲取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，研究其生長(zhǎng)特性、表面標(biāo)志及多向分化潛能，并在體外探索誘導(dǎo)其向肝臟樣細(xì)胞分化。有望為以細(xì)胞治療為基礎(chǔ)的再生醫(yī)學(xué)提供理想的干細(xì)胞來(lái)源，為生物性人工肝及肝組織工程提供種子細(xì)胞，進(jìn)而為終末期肝病及急性肝衰竭患者的治療帶來(lái)新希望。

1 材料和方法

1.1 材料

1)儀器:倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，CO2培養(yǎng)箱為日本Sanyo公司產(chǎn)品。

2)試劑:胰蛋白酶(EDTA)、雙抗均為美國(guó) Hyclone公司產(chǎn)品;DMEM(Dulbecco's Mldified Eagle's Medium)培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)緩沖液、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)均為美國(guó) Gibco公司產(chǎn)品;Ⅰ型膠原酶、地塞米松、胰島素、吲哚美辛、維生素C、1-甲基3-異丁基-黃嘌呤、β-甘油磷酸鈉、油紅O染色試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色試劑盒、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、牛血清白蛋白、慶大霉素、Triton(聚乙二醇辛基苯基醚)，山羊血清均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(human epidermal growth factor，HEGF)為美國(guó)Lonza公司產(chǎn)品。激活素A、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(fibroblast growth factor-4，F(xiàn)GF-4)、FGF-1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)、抑瘤素(Oncostatin M，OSM)均為美國(guó)Peprotech公司產(chǎn)品;中性甲醛為天津生物制藥公司產(chǎn)品。鼠抗人CD13-PE單克隆抗體、鼠抗人CD73-PE單克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體、鼠抗人CD45-FITC單克隆抗體、鼠抗人HLADRPE單克隆抗體均為美國(guó)Chemicon公司產(chǎn)品;鼠抗人HepPar-1單克隆抗體為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1)人脂肪干細(xì)胞提取:人脂肪組織取自在協(xié)和整形外科醫(yī)院接受腹部吸脂手術(shù)和皮膚瘢痕切除術(shù)的患者，術(shù)前均已簽訂知情同意書(shū)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)。干細(xì)胞分離方法參考Safford等［21］的實(shí)驗(yàn)方法。具體如下:將獲取的脂肪組織用75%乙醇泡30 s，足量的含5%雙抗的4℃ PBS液徹底洗滌10 min，去除肉眼可見(jiàn)的血管及皮膚組織;眼科剪剪碎＜1 mm3。用3倍于脂肪組織的含有1 mg/mLⅠ型膠原酶PBS培養(yǎng)基消化并置于搖床上持續(xù)輕輕搖晃2～3 h，加入等量含10%胎牛血清的低糖DMEM終止消化;室溫孵育10 min，900 g離心10 min。去掉上清及未完全消化的脂肪組織，用5 mL含10%FBS(fetal bovine serum)的 DMEM重懸，80目尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，900 g離心10 min。棄上清，用2 mL PBS重懸沉淀1 min，900 g離心5 min。去掉上清，加入2 mL含10%FBS的DMEM重懸沉淀1 min，再以140目過(guò)濾，收集濾液。

2)細(xì)胞培養(yǎng):倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，以1×104/cm2的密度接種于25 mm透氣培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37℃、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天首次換液，以后每3～4 d半量換液1次;待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%融合時(shí)，用含有EDTA的0.25%胰蛋白酶，并以1∶2密度傳代擴(kuò)增。

3)細(xì)胞增生能力、表面抗原及多向分化潛能檢測(cè):細(xì)胞增生能力檢測(cè):取第5代細(xì)胞，接種于24孔板，每孔含4×103個(gè)細(xì)胞;每天用含有EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)的0.25%胰蛋白酶消化3孔，離心后制成細(xì)胞懸液，在倒置顯微鏡下，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取其平均數(shù)，以細(xì)胞生長(zhǎng)的天數(shù)為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

細(xì)胞表面抗原檢測(cè):取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第5代hADSCs，胰酶消化，用PBS制成濃度1×106/mL的細(xì)胞懸液。向5個(gè)離心管中分別加入100 μL細(xì)胞懸液并分別加入大鼠抗人 CD13-PE、CD73-PE、CD34、CD45-FITC、HLA-DRPE 單抗各 10 μL，4 ℃ 避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

多向分化潛能檢測(cè):取生長(zhǎng)良好的第5代hASCs，以1×105/cm2的濃度接種于2個(gè)6孔板中，標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組;加入含10%胎牛血清的hASCs生長(zhǎng)培養(yǎng)基2 mL，24 h細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組換成成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對(duì)照組仍為hASCs生長(zhǎng)培養(yǎng)基，以后每3～4 d換液1次。成脂誘導(dǎo)采用細(xì)胞油紅O染色方法檢測(cè)，成骨誘導(dǎo)采用細(xì)胞ALP染色方法檢測(cè)。

4)向肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo):取生長(zhǎng)良好的第5代細(xì)胞，以1×105/cm2的濃度接種細(xì)胞，24 h細(xì)胞貼壁后，試驗(yàn)組加入含20 ng/mL激活素A(Activin A)，20 ng/mL FGF-4的第一階段培養(yǎng)基，3天后更換為含20 ng/mL EGF，5 μL/mL 慶大霉素，150 ng/mL HGF，100 ng/mL FGF-1，225 ng/mL FGF-4，20 ng/mL 制瘤素 M(OSM)，0.35 μL/mL 地塞米松，0.5 mg/mL 牛血清白蛋白，1 μL/mL 1×胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(ITS)的第二階段培養(yǎng)基，對(duì)照組一直使用hASCs生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

5)RT-PCR法檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞的基因表達(dá):收集2組細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄;RNA反轉(zhuǎn)錄體系混勻后，30 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，99 ℃ 滅活5 min，獲得的cDNA保存在-20℃。cDNA由特定引物(見(jiàn)表1)按PfuDNA聚合酶試劑盒說(shuō)明書(shū)體系，PCR反應(yīng)體系如下:10 ×Buffer 2.5 μL，Dntp 0.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，PFU 0.3 μL，cDNA 1 μL，水 18.7 μL。反應(yīng)條件:95℃ 10 min，40循環(huán)(95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s)最后72℃延伸5 min。結(jié)果取5 μL產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析檢測(cè)。

表1 RT-PCR所用引物序列及產(chǎn)物Tab.1 The primer sequences and product

6)PAS染色法檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞的糖原合成情況:采用PAS染色法檢測(cè)肝臟樣細(xì)胞糖原合成功能，具體如下:將制備的爬片用高碘酸氧化10 min;PBS清洗2次，5 min;Schiff試劑染15 min，避光反應(yīng);水洗;蘇木素復(fù)染，鏡下觀察。

7)細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法:10%的中性甲醛于室溫下固定15 min，0.25%的TritonX-100打孔液于室溫下通透，PBS清洗3次;然后用10%NGS封閉2 h，滴加第一抗體，4℃冰箱過(guò)夜。自冰箱中取出濕盒，室溫放置30 min，PBS清洗3次;滴加相應(yīng)2抗，DAB(1∶20)顯色，適時(shí)終止，蘇木素復(fù)染，鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)

新鮮分離的hADSCs呈較均一的圓形(圖1A);24 h后可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁(圖1B)，無(wú)明顯的形態(tài)變化;培養(yǎng)至第3天，可見(jiàn)紡錘狀細(xì)胞出現(xiàn)(圖1C);培養(yǎng)至第4、5、6天，可見(jiàn)紡錘狀細(xì)胞不斷增多(圖1D、E、F);培養(yǎng)至第7天，可見(jiàn)原代細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)70%(圖1G);培養(yǎng)至第8天可見(jiàn)細(xì)胞整合達(dá)90%以上，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，旋渦狀、輻射狀排列(圖1H)。

圖1 hADSCs細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.1 hADSCs cell morphology

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

細(xì)胞在前2天生長(zhǎng)較緩慢，第3天時(shí)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第6天細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量未增加，生長(zhǎng)呈停滯狀態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)單位為103個(gè)/cm2(圖2)。

圖2 hADSCs生長(zhǎng)曲線圖Fig.2 hADSCs growth curves

2.3 細(xì)胞表面抗原測(cè)定

流式細(xì)胞儀檢測(cè)第5代 hADSCs表面抗原，99.7%的細(xì)胞表達(dá)CD13，99.9%的細(xì)胞表達(dá)CD73，兩個(gè)干細(xì)胞表面抗原呈高表達(dá)狀態(tài);而僅有4.0%的細(xì)胞表達(dá)CD34，0.1%的細(xì)胞表達(dá)CD45，0.2%的細(xì)胞表達(dá)HLA-DR(圖3)。

2.4 細(xì)胞多向分化潛能測(cè)定結(jié)果

成脂誘導(dǎo)至第3周，絕大部分實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)被脂滴充滿，脂滴經(jīng)油紅O染色后呈鮮紅色(圖4A)，而對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性表達(dá)(圖4B);成骨誘導(dǎo)2周，可類似鈣結(jié)節(jié)的物質(zhì)出現(xiàn)，ALP染色，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)黑色顆粒(圖4C)，而對(duì)照組無(wú)黑色顆粒出現(xiàn)(圖4D)。

2.5 誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在誘導(dǎo)前呈長(zhǎng)梭形、成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，第一階段誘導(dǎo)至第2天，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始出現(xiàn)改變(圖5A);第一階段誘導(dǎo)至第3天時(shí)，部分細(xì)胞逐漸由長(zhǎng)梭形變成長(zhǎng)橢圓形、類圓形及多角形(圖5B)，第二階段誘導(dǎo)至第6、10、13天時(shí)，向類圓形細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)胞逐漸增加，呈肝臟樣細(xì)胞生長(zhǎng)(圖5C、D、E)，而對(duì)照組細(xì)胞仍保持成纖維細(xì)胞的形態(tài)，無(wú)形態(tài)變化(圖5F)。

圖3 hADSCs表面抗原表達(dá)情況Fig.3 hADSCs surface antigen expression

圖4 油紅O染色及ALP染色Fig.4 Oil red O staining and ALP staining(400 × )

圖5 誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察Fig.5 Induced cell morphology(400 × )

2.6 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞的肝細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)

第二階段誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，收集2組細(xì)胞RNA，RTPCR法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組肝臟樣細(xì)胞均檢測(cè)到AFP、ALB、CYP3A4肝細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，而未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照組細(xì)胞不表達(dá)AFP、CYP3A4，但表達(dá)ALB，不過(guò)表達(dá)強(qiáng)度要弱于實(shí)驗(yàn)組(圖6)。

2.7 細(xì)胞免疫組織化學(xué)

HepPar-1抗體識(shí)別的抗原存在于正常人肝細(xì)胞和大多數(shù)的肝細(xì)胞癌中，絕大多數(shù)的肝細(xì)胞癌為陽(yáng)性表達(dá)，是肝細(xì)胞相關(guān)的特異性抗體，也是現(xiàn)今病理科肝臟腫瘤鑒別與研究的重要指標(biāo)。甲胎蛋白AFP抗體用于檢測(cè)由肝細(xì)胞合成的糖蛋白抗體，可用于標(biāo)記肝癌細(xì)胞;角蛋白CK18、19抗體用于檢測(cè)腫瘤及細(xì)胞是否為上皮源性。這4個(gè)抗體的相關(guān)抗原，均存在于肝臟樣細(xì)胞的胞質(zhì)中。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)第二階段誘導(dǎo)至第13天時(shí)，經(jīng)細(xì)胞免疫組化法檢測(cè)可見(jiàn)胞質(zhì)中有HepPar-1、AFP、CK18、CK19 抗體表達(dá)(圖 7A、B、C、D)，與陽(yáng)性對(duì)照組的肝癌細(xì)胞表達(dá)一致(圖7E、F、G、H)，但陰性對(duì)照組細(xì)胞則為陰性表達(dá)(圖 7I、J、K、L)。

圖6 實(shí)驗(yàn)組(1)和對(duì)照組(2)肝細(xì)胞標(biāo)志物(AFP、ALB、CYP3A4)的 mRNA 表達(dá)Fig.6 The mRNA expression of liver cell markers(AFP，ALB，CYP3A4)of the experimental group(1)and the control group(2)

圖7 細(xì)胞免疫組織化學(xué)示肝細(xì)胞相關(guān)抗原表達(dá)情況Fig.7 The liver-associated antigen expression detected by cell immunohistochemistry(200 × )

2.8 PAS染色法檢測(cè)肝臟樣細(xì)胞的糖原合成功能

取誘導(dǎo)結(jié)束細(xì)胞，行PAS染色，可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)被染成紅色，胞核為藍(lán)色(圖8A)，誘導(dǎo)后的肝臟樣細(xì)胞生成了糖原類的物質(zhì)，而對(duì)照組細(xì)胞則呈陰性表達(dá)(圖8B)。

圖8 PAS染色檢測(cè)細(xì)胞的糖原合成功能Fig.8 The glycogen synthesis by capacity detected by PAS staining(200×)

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)［2］報(bào)道可獲得具有肝臟功能的細(xì)胞的途徑主要有:①肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)［22］;②胚胎、臍血干細(xì)胞體外誘導(dǎo)［23-24］;③IPS(induced pluripotent stem cell)細(xì)胞體外誘導(dǎo)［25］;④成體干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)［26-29］。然而，上述幾種途徑既能避免倫理限制、又能通過(guò)體外大量擴(kuò)增獲得安全性高的肝臟樣細(xì)胞的方法只有通過(guò)成體干細(xì)胞體外誘導(dǎo)。近年來(lái)，大量文獻(xiàn)［30-35］報(bào)道了不同組織來(lái)源的成體干細(xì)胞體外均能被誘導(dǎo)成肝臟樣細(xì)胞，包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)、外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)、脂肪干細(xì)胞(adipose tissue derived stem cells，ADSCs)、肝臟原位干細(xì)胞(HSL)等。目前僅有少數(shù)文獻(xiàn)［36-38］報(bào)道了脂肪來(lái)源干細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)成肝臟樣細(xì)胞。

2001年，Zuk等［14］發(fā)現(xiàn)在脂肪組織中含有一種與BMSCs來(lái)源于同一胚層的，具有相近生物學(xué)性質(zhì)的間充質(zhì)干細(xì)胞，可以發(fā)育成正常的軟骨和肌肉細(xì)胞等，并將這種細(xì)胞稱為脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue derived stem cells，ADSCs)。與其他成體干細(xì)胞相比，ADSCs取材容易，損傷小，可多次抽取;細(xì)胞數(shù)量多，體外增生速度快，且具有穩(wěn)定的倍增能力、低水平衰老。目前獲得hADSCs方法主要采用Ⅰ型膠原酶密度梯度離心法。本研究參考上述試驗(yàn)方法，將脂肪組織與含有1 mg/mLⅠ型膠原酶PBS混合后，在室溫下，置于搖床上持續(xù)輕輕搖晃2～3 h，而并非于37℃下?lián)u晃1 h;離心后得到大量成纖維樣細(xì)胞。結(jié)果顯示細(xì)胞數(shù)量并無(wú)明顯減少，而且體外培養(yǎng)顯示細(xì)胞生長(zhǎng)良好，很大程度上降低了分離hADSCs的試驗(yàn)要求，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。

在肝臟再生過(guò)程中起重要作用的細(xì)胞因子很多，目前應(yīng)用最廣泛的是 HGF［39-40］和 FGF-4［9，20］。HGF主要在肝臟枯否細(xì)胞(Kupffer)與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生。當(dāng)其濃度小至1 ng/mL時(shí)，對(duì)肝細(xì)胞就有促進(jìn)有絲分裂作用，是正常肝細(xì)胞最強(qiáng)的促有絲分裂劑;它的另一重要作用就是能增加細(xì)胞的能動(dòng)性［20］。Wang等［41］、張剛慶等［42］分別用 HGF 誘導(dǎo)大鼠骨髓 MSC，分化，均證明較高濃度HGF可誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞。Schwartz等［43］觀察了許多細(xì)胞因子(包括 aFGF、bFGF、FGF-4、HGF、FGF-7和OSM等)，發(fā)現(xiàn)只有FGF-4和HGF能誘導(dǎo)骨髓來(lái)源干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，認(rèn)為FGF-4也許在內(nèi)皮特化方面起重要作用，而HGF則能誘導(dǎo)非活躍增生狀態(tài)的肝細(xì)胞分化，通過(guò)二者的共同調(diào)控，HMSC的分化被激活從而分化為肝臟樣細(xì)胞。本研究采用二階段培養(yǎng)法，采用 HGF、FGF-4作為誘導(dǎo)劑，聯(lián)合應(yīng)用 EGF、OSM、DMSO等因子，促脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在體外向肝臟樣細(xì)胞分化，在誘導(dǎo)第3天時(shí)，部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的改變，由長(zhǎng)的梭形生長(zhǎng)成為類圓形或多角形;在誘導(dǎo)至第13天時(shí)，類圓形細(xì)胞進(jìn)一步增多，經(jīng)鑒定誘導(dǎo)的細(xì)胞具有肝臟樣細(xì)胞的功能。

本研究找到了一種經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的方法，為以后探索hADSCs的大量培養(yǎng)、純化的最佳條件和定向分化誘導(dǎo)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。盡管對(duì)誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞的功能尚需進(jìn)一步檢測(cè)，但從本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者初步認(rèn)定ADSCs具有向肝臟樣細(xì)胞分化的能力。ADSCs體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化的成功，可以通過(guò)體外單純的培養(yǎng)環(huán)境，研究肝臟干細(xì)胞分化過(guò)程的調(diào)控機(jī)制，認(rèn)識(shí)其發(fā)生發(fā)育規(guī)律，為肝病的細(xì)胞治療提供細(xì)胞來(lái)源。本課題通過(guò)Ⅰ型膠原酶密度梯度離心法從脂肪組織中分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，研究其形態(tài)特點(diǎn)、表面標(biāo)志及多向分化潛能，并研究誘導(dǎo)成功的肝臟樣細(xì)胞的生物學(xué)功能及表面標(biāo)志。有望為生物性人工肝及肝組織工程提供種子細(xì)胞，為以細(xì)胞治療為基礎(chǔ)的再生醫(yī)學(xué)提供理想的干細(xì)胞來(lái)源，進(jìn)而為終末期肝病及急性肝衰竭患者的治療帶來(lái)新希望。

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