對溴苯甲醛—4—苯基—2—噻唑脲與人血清蛋白相互作用的研究

林楓+楊水蘭+李明

摘要：采用熒光法研究了對溴苯甲醛-4-苯基-2-噻唑脲（BHP）與人血清蛋白（HSA）之間的相互作用。根據(jù)溴苯甲醛-4-苯基-2-噻唑脲與HSA相互作用的熒光敏華作用，利用Stern-Volmer方程及非輻射能量轉(zhuǎn)移理論處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用同步熒光光譜探討了BHP對HSA構(gòu)象的影響。結(jié)果表明，BHP可以使HSA的熒光增強(qiáng)，表明兩者之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，能量轉(zhuǎn)移的機(jī)理是BHP與HSA結(jié)合形成了復(fù)合物。熒光增強(qiáng)（敏化）效應(yīng)主要源于給體-受體間的偶極-偶極作用的能量轉(zhuǎn)移。能量轉(zhuǎn)移的結(jié)果為內(nèi)原發(fā)色基團(tuán)（給體donor）的熒光被猝滅和外源發(fā)色基團(tuán)（受體 acceptor）熒光被敏化，計(jì)算得到其敏化常數(shù)為 -2.494 5×104。同步熒光光譜表明，相互作用引起HSA構(gòu)象變化，提示結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸。

關(guān)鍵詞：對溴苯甲醛-4-苯基-2-噻唑脲；人血清蛋白；熒光光譜；同步熒光光譜

中圖分類號：R917 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）19-4578-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.017

The Interaction Between （E）-2-（2-（4-bromobenzylidene）hydrazinyl）-4-phenylthiazole and Albumin Human

LIN Feng， YANG Shui-lan， LI Ming

（School of Chemistry and Chemical Engineering， Ningxia University，Yinchuan 750021， China）

Abstract： To study the interaction between（E）-2-（2-（4-bromobenzylidene）hydrazinyl）-4-phenylthiazole （BHP） and Albumin Human by fluorescence， the Stern - Volmer curve and theory of non - radiation energy transfer was used to deal with the dates of fluorescence quench. The synchronous spectrum was used to investigate the conformational changes of HSA. Results showed that BHP enhanced the fluorescence of HSA. The mechanism of energy transfer was that BHP formed complexes with HSA. Fluorescence enhancement （sensitization effect） stemed mainly from the donor - the dipole-dipole effect between receptor and energy transfer. Fluorescence of the primary base group （to the body donor） was quenched and that of exogenous basement regiment receptors （acceptor） was sensitized. The sensitization constant was-2.494 5×104. Synchronous fluorescence spectra showed that the interaction caused change of HSA conformation， prompting binding sites closer to tryptophan.

Key words： （E）-2-（2-（4-bromobenzylidene）hydrazinyl）-4-phenylthiazole； Albumin Human； fluorescence spectroscopy； Synchronous fluorescence spectrum

對溴苯甲醛-4-苯基-2-噻唑脲（BHP）具有低毒、優(yōu)良的生物活性和結(jié)構(gòu)變化多樣等特點(diǎn)，在醫(yī)藥、材料和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的生物活性，該類農(nóng)藥已商品化，許多含吡唑基團(tuán)的化合物具有良好的除草、殺蟲、殺菌等[1，2]活性。BHP具有多個共軛雙鍵結(jié)構(gòu)、有熒光，有可能可以和DNA相互作用[3]，血清白蛋白是由許多氨基酸聚合而成的生物大分子化合物，其與營養(yǎng)、發(fā)育、遺傳、新陳代謝等生命活動等密切相關(guān)。當(dāng)藥物進(jìn)入血液后，可以高親和性與血清白蛋白可逆性結(jié)合，形成藥物-蛋白復(fù)合物。因此本研究試圖用熒光光譜法研究其與HSA相互作用的情況。有助于從分子水平上了解藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程以及進(jìn)一步闡明藥物在人體內(nèi)的作用機(jī)制，藥物代謝動力學(xué)和蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。不但對DNA的快速定量檢測、開發(fā)臨床診斷試劑方面有重要的意義，而且對闡述噻唑衍生物作為殺蟲劑的作用機(jī)理、新藥的設(shè)計(jì)研究有一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：F-4600熒光分光光度計(jì)，1.0 cm×1.0 cm石英熒光比色皿（晶科）； pH計(jì)；電子分析天平。PHS-3通用型酸度計(jì)（成都市三可儀器有限公司）。試劑：HSA（Sigma公司），用去離子水配制成1.0×10-5 mol/L的儲備液；對溴苯甲醛-4-苯基-2-噻唑脲（BHP，實(shí)驗(yàn)室自行合成[4，5]），用去離子水配制成1.120×10-4 mol/L的儲備液； 三羥基甲氧基氨基甲烷（Tris）、鹽酸均為分析純，配制0.05 mol/L，pH 7.4的緩沖溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

在1 cm×1 cm的石英比色皿中加入0.2 mL HSA儲備液及0.2 mL 0.1 mol/L緩沖液，依次加入不同量的BHP，反應(yīng)5 min。選擇激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射通帶均為10 nm。記錄300～400 nm的熒光光譜；固定激發(fā)和發(fā)射波長間隔Δλ分別為20 nm和60 nm，記錄同步熒光光譜[6，7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光敏化光譜

HSA分子中因含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等殘基而發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源熒光。在20 ℃，pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，改變BHP的濃度時的HSA熒光發(fā)射光譜如圖1所示。從圖1中可以看出，在波長283 nm下，隨著BHP濃度的增大，HSA的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，初步表明BHP具有熒光敏化效應(yīng)。2.2 BHP與HSA相互作用的敏化機(jī)理

許多藥物具有熒光，在加入蛋白質(zhì)后藥物的熒光會增強(qiáng)，還有一些藥物加入到蛋白質(zhì)溶液后會使蛋白質(zhì)熒光增強(qiáng)或有新的熒光峰出現(xiàn)，因此可以利用熒光增強(qiáng)研究蛋白質(zhì)分子與藥物的相互作用[8，9]。熒光增強(qiáng)（敏化）效應(yīng)主要源于給體-受體間的偶極-偶極作用的能量轉(zhuǎn)移。能量轉(zhuǎn)移的結(jié)果為內(nèi)原發(fā)色基團(tuán)（給體donor）的熒光被猝滅和外源發(fā)色基團(tuán)（受體 acceptor）熒光被敏化。

2.3 敏化常數(shù)的確定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及繪制的圖形，能很清楚的看到加入藥物后熒光強(qiáng)度明顯的增強(qiáng)。根據(jù)文獻(xiàn)[1]的觀點(diǎn)，用熒光加強(qiáng)公式來研究藥物對蛋白質(zhì)的猝滅作用也能夠得到非常好的結(jié)果，盡管兩個理論公式的表觀形式不同，但所得結(jié)果卻很接近.這表明兩個理論方程的等效性和合理性以及所得結(jié)果的可信度，所以也可以用熒光猝滅的公式來研究熒光敏化作用[10，11]。

熒光猝滅光譜法研究化學(xué)和生物體系的有效手段是根據(jù)Stcm-Volmer方程：

F0/F=1+Kqτ0 [Q]=l+KsvQ

式中，F(xiàn)0和F分別是不存在和存在猝滅劑時的熒光強(qiáng)度，[Q]為猝滅劑的濃度，Kq為雙分子猝滅速率，τ0是不存在猝滅劑時熒光體的熒光壽命，Ksv是Stem-Volmer猝滅常數(shù)。為了闡明其敏化機(jī)理，作出溫度為20 ℃下HSA與BHP作用的stem-Voliner圖（圖2）。

從圖2中可以看出曲線有良好的線性關(guān)系，直線斜率為負(fù)值即Ksv為負(fù)值，表明不存在藥物時HSA的熒光強(qiáng)度比存在藥物時的小，進(jìn)一步證明此藥物會使HSA的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，即表現(xiàn)為熒光敏化。由于生物大分子的熒光壽命τ0約為10-8 s，根據(jù)Kq=Ksv/τ0，故猝滅速率常數(shù)Kq的數(shù)量級可以達(dá)到1 012 L/（mol·s）。一般認(rèn)為，各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)為2×l 010 L/（mol·s），顯然，Kq也為負(fù)值，更進(jìn)一步證明此藥物使HSA的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

2.4 BHP對HSA構(gòu)象的影響

同步熒光光譜因具有簡化光譜、窄化譜帶和減小光譜重疊等優(yōu)點(diǎn)而常被用于研究藥物分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。同步熒光光譜可以反應(yīng)藥物分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，固定激發(fā)波長和發(fā)射波長的間距Δλ，同步掃描激發(fā)波和發(fā)射波即可得到同步熒光光譜（圖3、圖4）。

蛋白質(zhì)的熒光是由色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸產(chǎn)生的熒光所共同形成的。在同步掃描過程中，當(dāng)波長差Δλ=15 nm時，只表現(xiàn)出酪氨酸殘基的熒光（圖3）；隨著藥物的加入，最大發(fā)射波長有輕微的藍(lán)移，說明由于藥物與HSA的作用，酪氨酸殘基所處微環(huán)境的極性降低，疏水性增強(qiáng)。

當(dāng)Δλ=60 nm時，主要是色氨酸殘基發(fā)射的熒光。而色氨酸的最大熒光發(fā)射波長與其所處的介質(zhì)環(huán)境有關(guān)。從Δλ=60 nm的同步熒光光譜圖4中可以看出，色氨酸殘基的發(fā)射波長有輕微的紅移，證明HSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性增大，疏水性減弱，肽鏈的伸展程度有所增加。所以BHP引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

3 小結(jié)與討論

通過熒光光譜法研究BHP與HSA的相互作用，得到了良好的敏化現(xiàn)象。同時研究同步熒光光譜得出BHP使HSA構(gòu)象發(fā)生變化。需要指出的是，用熒光猝滅理論的公式研究熒光敏化是假定給體與受體之間生成了結(jié)合物，即在藥物低濃度時基本屬于加強(qiáng)。研究藥物與血清白蛋白的相互作用，有助于從分子水平上了解藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程以及進(jìn)一步闡明藥物在人體內(nèi)的作用機(jī)制，藥物代謝動力學(xué)和蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

參考文獻(xiàn)：

[1] 戴 紅，趙元飛，牛 平，等.1-{4-[（2-氰基亞胺基-1，3-噻唑烷-3-基）甲基]-噻唑-2-基}-3-取代苯甲酰基脲類化合物的合成及其生物活性[J].有機(jī)化學(xué)，2013（33）：1568-1572.

[2] 崔勝峰，王 艷，呂 敬，等.噻唑類化合物應(yīng)用研究新進(jìn)展[J].中國科學(xué)，2012，42（8）：1105-1131.

[3] 王平紅.一些金屬配合物和DNA相互作用的研究[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2006.

[4] 阿布拉江·克依木，王立舉.3-（2-萘基）-1-苯基-吡唑-4-甲醛腙衍生物的簡便合成與表征[J].有機(jī)化學(xué)，2012（32）：2358-2362.

[5] 李 明.甲鈷胺的合成研究與縮氨基硫脲及其衍生物的合成[D].銀川：寧夏大學(xué)，2008.

[6] 邢惟青，黃鵬翔，丘玉昌，等.現(xiàn)代熒光光譜法在藥物與蛋白相互作用研究中的應(yīng)用[J].華西醫(yī)藥雜志，2011，26（5）：503-507.

[7] 孫 洋，樊 君，胡曉云，等.熒光素鈉與牛血清蛋白相互作用的熒光光譜研究及其分析應(yīng)用[J].化學(xué)學(xué)報，2011，69（8）：937-944.

[8] 尚永輝，李 華，孫家娟，等.熒光光譜法研究抗癌藥物羥基喜樹堿與牛血清白蛋白的相互作用[J]藥物分析雜志，2010，30（1）：59-62.

[9] 尚永輝，李 華，孫家娟，等.熒光光譜法研究大豆甙元與牛血清白蛋白的相互作用[J].分析科學(xué)學(xué)報，2011，27（5）：623-626.

[10] 蘇碧泉.蘆丁金屬配合物與相互作用研究[D].蘭州：西北師范大學(xué)，2006.

[11] 楊曼曼，席小莉.用熒光猝滅和熒光加強(qiáng)兩種理論研究喹諾酮類新藥與白蛋白的作用[J].高等化學(xué)學(xué)報，2006（4）：687-691.

1.2 試驗(yàn)方法

在1 cm×1 cm的石英比色皿中加入0.2 mL HSA儲備液及0.2 mL 0.1 mol/L緩沖液，依次加入不同量的BHP，反應(yīng)5 min。選擇激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射通帶均為10 nm。記錄300～400 nm的熒光光譜；固定激發(fā)和發(fā)射波長間隔Δλ分別為20 nm和60 nm，記錄同步熒光光譜[6，7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光敏化光譜

HSA分子中因含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等殘基而發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源熒光。在20 ℃，pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，改變BHP的濃度時的HSA熒光發(fā)射光譜如圖1所示。從圖1中可以看出，在波長283 nm下，隨著BHP濃度的增大，HSA的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，初步表明BHP具有熒光敏化效應(yīng)。2.2 BHP與HSA相互作用的敏化機(jī)理

許多藥物具有熒光，在加入蛋白質(zhì)后藥物的熒光會增強(qiáng)，還有一些藥物加入到蛋白質(zhì)溶液后會使蛋白質(zhì)熒光增強(qiáng)或有新的熒光峰出現(xiàn)，因此可以利用熒光增強(qiáng)研究蛋白質(zhì)分子與藥物的相互作用[8，9]。熒光增強(qiáng)（敏化）效應(yīng)主要源于給體-受體間的偶極-偶極作用的能量轉(zhuǎn)移。能量轉(zhuǎn)移的結(jié)果為內(nèi)原發(fā)色基團(tuán)（給體donor）的熒光被猝滅和外源發(fā)色基團(tuán)（受體 acceptor）熒光被敏化。

2.3 敏化常數(shù)的確定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及繪制的圖形，能很清楚的看到加入藥物后熒光強(qiáng)度明顯的增強(qiáng)。根據(jù)文獻(xiàn)[1]的觀點(diǎn)，用熒光加強(qiáng)公式來研究藥物對蛋白質(zhì)的猝滅作用也能夠得到非常好的結(jié)果，盡管兩個理論公式的表觀形式不同，但所得結(jié)果卻很接近.這表明兩個理論方程的等效性和合理性以及所得結(jié)果的可信度，所以也可以用熒光猝滅的公式來研究熒光敏化作用[10，11]。

熒光猝滅光譜法研究化學(xué)和生物體系的有效手段是根據(jù)Stcm-Volmer方程：

F0/F=1+Kqτ0 [Q]=l+KsvQ

式中，F(xiàn)0和F分別是不存在和存在猝滅劑時的熒光強(qiáng)度，[Q]為猝滅劑的濃度，Kq為雙分子猝滅速率，τ0是不存在猝滅劑時熒光體的熒光壽命，Ksv是Stem-Volmer猝滅常數(shù)。為了闡明其敏化機(jī)理，作出溫度為20 ℃下HSA與BHP作用的stem-Voliner圖（圖2）。

從圖2中可以看出曲線有良好的線性關(guān)系，直線斜率為負(fù)值即Ksv為負(fù)值，表明不存在藥物時HSA的熒光強(qiáng)度比存在藥物時的小，進(jìn)一步證明此藥物會使HSA的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，即表現(xiàn)為熒光敏化。由于生物大分子的熒光壽命τ0約為10-8 s，根據(jù)Kq=Ksv/τ0，故猝滅速率常數(shù)Kq的數(shù)量級可以達(dá)到1 012 L/（mol·s）。一般認(rèn)為，各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)為2×l 010 L/（mol·s），顯然，Kq也為負(fù)值，更進(jìn)一步證明此藥物使HSA的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

2.4 BHP對HSA構(gòu)象的影響

同步熒光光譜因具有簡化光譜、窄化譜帶和減小光譜重疊等優(yōu)點(diǎn)而常被用于研究藥物分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。同步熒光光譜可以反應(yīng)藥物分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，固定激發(fā)波長和發(fā)射波長的間距Δλ，同步掃描激發(fā)波和發(fā)射波即可得到同步熒光光譜（圖3、圖4）。

蛋白質(zhì)的熒光是由色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸產(chǎn)生的熒光所共同形成的。在同步掃描過程中，當(dāng)波長差Δλ=15 nm時，只表現(xiàn)出酪氨酸殘基的熒光（圖3）；隨著藥物的加入，最大發(fā)射波長有輕微的藍(lán)移，說明由于藥物與HSA的作用，酪氨酸殘基所處微環(huán)境的極性降低，疏水性增強(qiáng)。

當(dāng)Δλ=60 nm時，主要是色氨酸殘基發(fā)射的熒光。而色氨酸的最大熒光發(fā)射波長與其所處的介質(zhì)環(huán)境有關(guān)。從Δλ=60 nm的同步熒光光譜圖4中可以看出，色氨酸殘基的發(fā)射波長有輕微的紅移，證明HSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性增大，疏水性減弱，肽鏈的伸展程度有所增加。所以BHP引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

3 小結(jié)與討論

通過熒光光譜法研究BHP與HSA的相互作用，得到了良好的敏化現(xiàn)象。同時研究同步熒光光譜得出BHP使HSA構(gòu)象發(fā)生變化。需要指出的是，用熒光猝滅理論的公式研究熒光敏化是假定給體與受體之間生成了結(jié)合物，即在藥物低濃度時基本屬于加強(qiáng)。研究藥物與血清白蛋白的相互作用，有助于從分子水平上了解藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程以及進(jìn)一步闡明藥物在人體內(nèi)的作用機(jī)制，藥物代謝動力學(xué)和蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

參考文獻(xiàn)：

[1] 戴 紅，趙元飛，牛 平，等.1-{4-[（2-氰基亞胺基-1，3-噻唑烷-3-基）甲基]-噻唑-2-基}-3-取代苯甲?；孱惢衔锏暮铣杉捌渖锘钚訹J].有機(jī)化學(xué)，2013（33）：1568-1572.

[2] 崔勝峰，王 艷，呂 敬，等.噻唑類化合物應(yīng)用研究新進(jìn)展[J].中國科學(xué)，2012，42（8）：1105-1131.

[3] 王平紅.一些金屬配合物和DNA相互作用的研究[D].海口：海南大學(xué)，2006.

[4] 阿布拉江·克依木，王立舉.3-（2-萘基）-1-苯基-吡唑-4-甲醛腙衍生物的簡便合成與表征[J].有機(jī)化學(xué)，2012（32）：2358-2362.

[5] 李 明.甲鈷胺的合成研究與縮氨基硫脲及其衍生物的合成[D].銀川：寧夏大學(xué)，2008.

[6] 邢惟青，黃鵬翔，丘玉昌，等.現(xiàn)代熒光光譜法在藥物與蛋白相互作用研究中的應(yīng)用[J].華西醫(yī)藥雜志，2011，26（5）：503-507.

[7] 孫 洋，樊 君，胡曉云，等.熒光素鈉與牛血清蛋白相互作用的熒光光譜研究及其分析應(yīng)用[J].化學(xué)學(xué)報，2011，69（8）：937-944.

[8] 尚永輝，李 華，孫家娟，等.熒光光譜法研究抗癌藥物羥基喜樹堿與牛血清白蛋白的相互作用[J]藥物分析雜志，2010，30（1）：59-62.

[9] 尚永輝，李 華，孫家娟，等.熒光光譜法研究大豆甙元與牛血清白蛋白的相互作用[J].分析科學(xué)學(xué)報，2011，27（5）：623-626.

[10] 蘇碧泉.蘆丁金屬配合物與相互作用研究[D].蘭州：西北師范大學(xué)，2006.

[11] 楊曼曼，席小莉.用熒光猝滅和熒光加強(qiáng)兩種理論研究喹諾酮類新藥與白蛋白的作用[J].高等化學(xué)學(xué)報，2006（4）：687-691.

1.2 試驗(yàn)方法

在1 cm×1 cm的石英比色皿中加入0.2 mL HSA儲備液及0.2 mL 0.1 mol/L緩沖液，依次加入不同量的BHP，反應(yīng)5 min。選擇激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射通帶均為10 nm。記錄300～400 nm的熒光光譜；固定激發(fā)和發(fā)射波長間隔Δλ分別為20 nm和60 nm，記錄同步熒光光譜[6，7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光敏化光譜

HSA分子中因含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等殘基而發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源熒光。在20 ℃，pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，改變BHP的濃度時的HSA熒光發(fā)射光譜如圖1所示。從圖1中可以看出，在波長283 nm下，隨著BHP濃度的增大，HSA的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，初步表明BHP具有熒光敏化效應(yīng)。2.2 BHP與HSA相互作用的敏化機(jī)理

許多藥物具有熒光，在加入蛋白質(zhì)后藥物的熒光會增強(qiáng)，還有一些藥物加入到蛋白質(zhì)溶液后會使蛋白質(zhì)熒光增強(qiáng)或有新的熒光峰出現(xiàn)，因此可以利用熒光增強(qiáng)研究蛋白質(zhì)分子與藥物的相互作用[8，9]。熒光增強(qiáng)（敏化）效應(yīng)主要源于給體-受體間的偶極-偶極作用的能量轉(zhuǎn)移。能量轉(zhuǎn)移的結(jié)果為內(nèi)原發(fā)色基團(tuán)（給體donor）的熒光被猝滅和外源發(fā)色基團(tuán)（受體 acceptor）熒光被敏化。

2.3 敏化常數(shù)的確定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及繪制的圖形，能很清楚的看到加入藥物后熒光強(qiáng)度明顯的增強(qiáng)。根據(jù)文獻(xiàn)[1]的觀點(diǎn)，用熒光加強(qiáng)公式來研究藥物對蛋白質(zhì)的猝滅作用也能夠得到非常好的結(jié)果，盡管兩個理論公式的表觀形式不同，但所得結(jié)果卻很接近.這表明兩個理論方程的等效性和合理性以及所得結(jié)果的可信度，所以也可以用熒光猝滅的公式來研究熒光敏化作用[10，11]。

熒光猝滅光譜法研究化學(xué)和生物體系的有效手段是根據(jù)Stcm-Volmer方程：

F0/F=1+Kqτ0 [Q]=l+KsvQ

式中，F(xiàn)0和F分別是不存在和存在猝滅劑時的熒光強(qiáng)度，[Q]為猝滅劑的濃度，Kq為雙分子猝滅速率，τ0是不存在猝滅劑時熒光體的熒光壽命，Ksv是Stem-Volmer猝滅常數(shù)。為了闡明其敏化機(jī)理，作出溫度為20 ℃下HSA與BHP作用的stem-Voliner圖（圖2）。

從圖2中可以看出曲線有良好的線性關(guān)系，直線斜率為負(fù)值即Ksv為負(fù)值，表明不存在藥物時HSA的熒光強(qiáng)度比存在藥物時的小，進(jìn)一步證明此藥物會使HSA的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，即表現(xiàn)為熒光敏化。由于生物大分子的熒光壽命τ0約為10-8 s，根據(jù)Kq=Ksv/τ0，故猝滅速率常數(shù)Kq的數(shù)量級可以達(dá)到1 012 L/（mol·s）。一般認(rèn)為，各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)為2×l 010 L/（mol·s），顯然，Kq也為負(fù)值，更進(jìn)一步證明此藥物使HSA的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

2.4 BHP對HSA構(gòu)象的影響

同步熒光光譜因具有簡化光譜、窄化譜帶和減小光譜重疊等優(yōu)點(diǎn)而常被用于研究藥物分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。同步熒光光譜可以反應(yīng)藥物分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，固定激發(fā)波長和發(fā)射波長的間距Δλ，同步掃描激發(fā)波和發(fā)射波即可得到同步熒光光譜（圖3、圖4）。

蛋白質(zhì)的熒光是由色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸產(chǎn)生的熒光所共同形成的。在同步掃描過程中，當(dāng)波長差Δλ=15 nm時，只表現(xiàn)出酪氨酸殘基的熒光（圖3）；隨著藥物的加入，最大發(fā)射波長有輕微的藍(lán)移，說明由于藥物與HSA的作用，酪氨酸殘基所處微環(huán)境的極性降低，疏水性增強(qiáng)。

當(dāng)Δλ=60 nm時，主要是色氨酸殘基發(fā)射的熒光。而色氨酸的最大熒光發(fā)射波長與其所處的介質(zhì)環(huán)境有關(guān)。從Δλ=60 nm的同步熒光光譜圖4中可以看出，色氨酸殘基的發(fā)射波長有輕微的紅移，證明HSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性增大，疏水性減弱，肽鏈的伸展程度有所增加。所以BHP引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

3 小結(jié)與討論

通過熒光光譜法研究BHP與HSA的相互作用，得到了良好的敏化現(xiàn)象。同時研究同步熒光光譜得出BHP使HSA構(gòu)象發(fā)生變化。需要指出的是，用熒光猝滅理論的公式研究熒光敏化是假定給體與受體之間生成了結(jié)合物，即在藥物低濃度時基本屬于加強(qiáng)。研究藥物與血清白蛋白的相互作用，有助于從分子水平上了解藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程以及進(jìn)一步闡明藥物在人體內(nèi)的作用機(jī)制，藥物代謝動力學(xué)和蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

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