氟尿嘧啶和奧沙利鉑在胃癌中的體外化療敏感性檢測*

陳小東，趙 平，丁 志，周 祥，肖碩萌，唐令超

(四川省腫瘤醫(yī)院·研究所胃腸外科，成都610041)

胃癌是我國常見惡性腫瘤之一，最新的癌癥登記數(shù)據(jù)表明其年發(fā)病率為36．21/10萬人(男性49．61/10萬人，女性 22．50/10 萬人)，年新增病例約40．5萬人，居惡性腫瘤第二位(構(gòu)成比為12．67%);死亡率為 25．88/10 萬人(男性 34．64/10萬人，女性16．91/10萬人)，年死亡人數(shù)約32．5萬人，居惡性腫瘤第三位(構(gòu)成比為 14．33%)［1-2］。由于沒有開展廣泛的人群早期篩查，我國早期胃癌的診斷率很低，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)晚，確診時已屬進(jìn)展期，部分患者甚至已屬不能手術(shù)切除或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移僅能行姑息性化療的晚期病例，即使行了根治性切除的患者，大部分也需要輔助性化療［3］。系統(tǒng)評價及Meta-分析顯示根治術(shù)后的輔助化療可以顯著降低復(fù)發(fā)率、提高治愈率，而晚期胃癌的姑息化療也可以延長生存期并改善生活質(zhì)量［4-5］。然而，目前胃癌化療的有效率較低，輔助化療僅能提高治愈率10%左右，而姑息化療的有效率也僅為10%～50%，其根本原因可能在于胃癌是高度異質(zhì)性的一類腫瘤，建立在群體樣本研究基礎(chǔ)上的“標(biāo)準(zhǔn)化療方案”沒有考慮到個體的差異性［6］。因此，為進(jìn)一步提高化療的有效性就要求從“標(biāo)準(zhǔn)化”向“個體化”發(fā)展。目前，體外腫瘤化療藥物敏感性檢測是實現(xiàn)個體化治療的有效措施之一。本研究采用三磷酸腺苷腫瘤化療藥物敏感性檢測法(ATP-TCA)對27例新鮮胃癌手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行體外化療敏感性檢測，以期為術(shù)后化療方案的選擇提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1．1 患者

本研究納入的患者為2014年1月至2014年6月在我院經(jīng)胃鏡活檢初次確診的胃癌患者，術(shù)前簽署書面知情同意書，同意行化療藥物敏感性檢測。排除行術(shù)前新輔助化療或同時診斷患有其他惡性腫瘤的患者。所有患者均行胃切除術(shù)加D2淋巴結(jié)清掃術(shù)。使用設(shè)計好的數(shù)據(jù)表前瞻性錄入患者的臨床病理特征，包括年齡、性別、腫瘤位置、Bormann分型、組織學(xué)分類、術(shù)后TNM分期、脈管侵犯及神經(jīng)侵犯等［7］。術(shù)前結(jié)合胃鏡及CT按腫瘤主體所在部位判定腫瘤位置，并經(jīng)術(shù)中證實或修正。

1．2 主要儀器和試劑

高靈敏度板式化學(xué)發(fā)光檢測儀(OrionⅡ，德國Berthold Detection Systems公司)、低速大容量離心機(jī)、倒置顯微鏡、超凈臺、CO2培養(yǎng)箱、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板;ATP生物熒光腫瘤藥物敏感性檢測試劑盒(湖州海創(chuàng)生物科技有限公司)、完全培養(yǎng)液(CAM)、腫瘤組織消化酶(TDE)、ATP抽提劑(TCE)、紅細(xì)胞裂解液、熒光素-熒光素酶工作液和ATP標(biāo)準(zhǔn)液。

1．3 體外化療藥物敏感性檢測

新鮮的胃癌標(biāo)本取材后放入一次性的培養(yǎng)皿中，吹打標(biāo)本并吸去浸泡液;加75%酒精浸沒標(biāo)本并吹打1～2分鐘，吸去酒精，在含抗生素(青霉素200U/ml和鏈霉素200U/ml)的培養(yǎng)基中浸泡25分鐘后，吸去浸泡液，用剪刀鑷子剪成糊狀，肉眼基本看不到顆粒，置于15ml離心管中，加入6ml含混合消化酶的培養(yǎng)基，于37℃消化2h。200目篩網(wǎng)過濾，獲得單細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)基洗滌2次。臺盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)。

先加待測藥物于96孔培養(yǎng)板，所用藥物及100%TDC(測試藥物濃度)參考藥物在人體內(nèi)的血漿濃度設(shè)定為:氟尿嘧啶(5-FU 25μg/ml)、奧沙利鉑(OX 5μg/ml)，聯(lián)合用藥的每個藥物濃度與單藥濃度相同［8-9］。每個藥物設(shè)200%、100%、50%、25%、12．5%TDC五個濃度，每個濃度2個平行孔，并設(shè)2排(8孔)無藥孔作對照，一排為無藥對照(M0)，一排為空白對照(MI)，僅200ul完全培養(yǎng)基，作為檢測本底值。接種腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)為2×104個/孔。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5天后，按試劑盒說明書操作測定熒光值。

1．4 結(jié)果參數(shù)及敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)

檢測系統(tǒng)軟件自動分析每種測試藥物濃度(Test Drug Concentration，TDC)的腫瘤生長抑制率(Tumor Growth Inhibition Rate，TGI)，繪制藥物濃度-腫瘤細(xì)胞生長抑制曲線(橫坐標(biāo)X軸為TDC，縱坐標(biāo)Y軸為TGI)，計算抑制曲線下面積(area under the curve，AUC)、化療敏感指數(shù)(chemosensitivity index，CSI)、IC50 及 IC90，其計算方法如下:

TGI:(1-藥物處理孔熒光均值/無藥對照孔熒光均值)×100%。

AUC:按梯形法則進(jìn)行X、Y軸坐標(biāo)計算測試藥物濃度(TDC)百分比VS抑制腫瘤生長(TGI)百分比，其值越大代表這個化療藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制性越好。

CSI:CSI=500-各TDC的抑制率之和，其值越小表示這個化療藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制率高。

IC90:抑制90%腫瘤細(xì)胞生長的TDC。IC50:抑制50%腫瘤細(xì)胞生長的TDC。

化療敏感性根據(jù)以下三種進(jìn)行分類:敏感:IC50≤25%TDC;輕度敏感:IC90≤100%TDC且IC50＞25%，或CSI≤300;耐藥:IC90＞100%TDC且 IC50＞25%且 CSI＞300。

1．5 統(tǒng)計學(xué)方法

計數(shù)資料采用例數(shù)及百分比表示，不同化療藥物之間的比較采用兩相關(guān)樣本W(wǎng)ilcoxon符號秩檢驗(Two-Related-Samples Wilcoxon Signed Ranks test);計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，不同化療方案之間的比較采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計的方差分析，并采用LSD法進(jìn)行兩兩比較;多因素分析采用Logistic回歸分析，采用逐步向前法(Forward Stepwise)選擇變量進(jìn)入回歸模型，并依據(jù)似然比(Likelihood Ratio)檢驗的結(jié)果剔除變量，在結(jié)果中僅將納入回歸模型的變量列出。以P﹤0．05為有統(tǒng)計學(xué)意義。所有統(tǒng)計學(xué)操作采用SPSS 16．0完成。

2 結(jié)果

2．1 納入患者的臨床病理特征

共納入27例患者，其中老年患者14例(51．9%)、男性21例(77．8%)、腫瘤位于遠(yuǎn)側(cè)部14 例(51．9%)、低分化及印戒細(xì)胞癌共20例(74．1%)、TNM Ⅲ+Ⅳ期21例(77．8%)(見表1)。

表1 患者的臨床病理特征

特征 例數(shù)(n=27)%TNM 分期Ⅰ期 3 11．1Ⅱ期 3 11．1Ⅲ期 18 66．7Ⅳ期 3 11．1脈管侵犯否19 70．4是8 29．6神經(jīng)侵犯否19 70．4是8 29．6

2．2 體外化療敏感性檢測結(jié)果

2.2.1 腫瘤生長抑制率(TGI) 三種化療方案不同TDC對來自同一標(biāo)本的腫瘤細(xì)胞生長具有抑制作用(見圖1)，抑制作用高低依次是5-FU+OX、OX和5-FU，而且后兩條抑制曲線較為接近。

圖1 腫瘤生長抑制曲線

三種化療方案TDC越高對胃癌細(xì)胞生長的抑制率也越高，且5-FU+OX在各個TDC的TGI均顯著高于5-FU或OX(見表2)。

2.2.2 TGI相關(guān)參數(shù)及化療敏感性判定 5-FU+OX的AUC均顯著高于5-FU或OX，而其CSI、IC90和IC50顯著低于5-FU或OX。5-FU、OX及5-FU+OX的敏感性(敏感 +輕度敏感)依次為18．5%、14．8%及55．6%，5-FU+OX的敏感性顯著高于5-FU 或 OX(5-FU+OX vs．5-FU:P=0．001 和5-FU+OX vs．OX:P=0．003)(見表 3)。

三種化療方案的CSI頻率直方圖顯示其分布近似于正態(tài)分布，敏感性較高的5-FU+OX的峰值更靠左(見圖2)。

表2 四種化療方案不同藥物濃度(TDC)的腫瘤生長抑制率(TGI)

表3 TGI相關(guān)參數(shù)及化療敏感性判定結(jié)果

圖2 三種化療方案的CSI頻率直方圖

2．3 多因素回歸分析

將表1所列臨床病理特征納入多因素回歸分析顯示，盡管對5-FU敏感的均為遠(yuǎn)側(cè)部胃癌，但單因素分析(Fisher's Exact Test:P=0．078)及多因素分析(P=0．998)均顯示無顯著相關(guān)性;OX的敏感性與Borrmann分型有顯著相關(guān)性(P=0．025)，BorrmannⅢ、Ⅳ型高于Ⅱ型(OR=7．570);5-FU+OX的敏感性與腫瘤位置有顯著相關(guān)(P=0．019)，遠(yuǎn)側(cè)部胃癌中的敏感性顯著高于近側(cè)部(OR=3．427)(見表4)。

表4 化療敏感性相關(guān)因素分析

3 討論

盡管根治性手術(shù)仍是目前唯一有可能治愈胃癌的治療措施，但是術(shù)后輔助化療的作用也逐漸得到了廣泛認(rèn)可，其目的是為了防止微小殘留腫瘤復(fù)發(fā)。一項國際協(xié)作的針對較早期的隨機(jī)對照試驗的meta-分析顯示:輔助化療使胃癌患者的5年無疾病生存率提高5．3%(從48．7% 到 54．0%)，5 年和10年總生存率分別提高5．8%(從49．6%到55．3%)和 7．4%(從 37．5%到 44．9%)，中位生存時間延長2．9 年(從 4．9 到7．8 年)［10］。

近年由于化療新藥的出現(xiàn)，輔助化療的效果有了進(jìn)一步提高。日本進(jìn)行的ACTS-GC試驗采用S-1單藥輔助化療，結(jié)果顯示與單純手術(shù)相比，3年和5年無疾病生存率分別提高12．6%(從59．6%到72．2%)和12．3%(從 53．1% 到 65．4%)，3 年和 5年總生存率分別提高10．0%(從70．1% 到80．1%)和 10．6%(從 61．1% 到 71．7%)［11-12］。而中韓兩國進(jìn)行的CLASSIC試驗采用卡培他濱加奧沙利鉑的聯(lián)合方案輔助化療，結(jié)果顯示與單純手術(shù)相比，3年無疾病生存率提高15%(從59%到74%)，3年總生存率提高5%(從78% 到83%)［13］。

基于大樣本的Ⅲ期臨床隨機(jī)對照試驗結(jié)果，美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)2014年NCCN指南推薦的輔助化療方案為卡培他濱加奧沙利鉑或順鉑的聯(lián)合方案［14］，日本胃癌學(xué)會2010年第三版胃癌治療指南推薦的是S-1單藥［15］，而我國衛(wèi)生部制定的2011年版《胃癌診療規(guī)范》推薦氟尿嘧啶類聯(lián)合鉑類的兩藥聯(lián)合方案［16］。盡管目前胃癌輔助化療取得了可喜的進(jìn)步，但遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿意的程度，因為大量接受根治性手術(shù)及輔助化療的患者仍然出現(xiàn)復(fù)發(fā)。除了進(jìn)一步開發(fā)更敏感的化療藥之外，如何更充分有效地發(fā)揮現(xiàn)有藥物的作用卻是更現(xiàn)實的做法。分子靶向藥物的廣泛使用開啟了腫瘤“個體化”治療的大門，同樣，在尋找“標(biāo)準(zhǔn)化療方案”的同時，“個體化化療”的理念也逐漸興起。

體外化療敏感性檢測可以為化療藥物的個體化選擇提供參考，多項臨床研究證實其有較高的臨床符合率，在多種腫瘤的治療中取得了明顯的效果［17-18］。數(shù)項來自韓國的研究也初步表明了ATP-TCA法在胃癌治療中的價值［19-22］?；谇笆鲋改贤扑]的術(shù)后輔助化療方案及我們目前臨床實踐的實際情況，我們采用ATP-TCA法檢測了5-FU、OX及5-FU+OX在胃癌中的敏感性，結(jié)果表明5-FU+OX顯示出比5-FU或OX更高的體外化療敏感性。然而，需要特別注意的是體外試驗并不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境。實際上，藥物的體內(nèi)過程十分復(fù)雜，不同的給藥途徑(如靜脈注射、滴注、持續(xù)泵入或口服給藥)會影響藥物的吸收及分布，藥物進(jìn)入體內(nèi)后還要經(jīng)歷獨特而復(fù)雜的藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)過程;體外試驗?zāi)Ｐ蛣t是高度理想化和簡單化的體系，只能在一定程度上模擬體內(nèi)的環(huán)境，在本研究中測試藥物濃度即是對藥物在人體內(nèi)的血漿濃度值的等效轉(zhuǎn)換，然而，這種等效轉(zhuǎn)換卻并不能直接等同于體內(nèi)療效。有鑒于此，我們也正在對體外試驗的結(jié)果與體內(nèi)療效的相關(guān)性進(jìn)行長期的臨床觀察。

影響胃癌預(yù)后的因素包括治療措施、TNM分期、腫瘤位置、分化程度、脈管侵犯、種族、性別及年齡等，近側(cè)部胃癌是不良預(yù)后因素，而亞洲人、女性及年輕為良好的預(yù)后因素［23］。本研究采用多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)OX和5-FU+OX的敏感性分別與Borrmann分型和腫瘤位置有顯著相關(guān)性。因為本研究病例數(shù)較少，尚難以做出肯定的結(jié)論，因此需要增加病例數(shù)進(jìn)一步驗證。然而，值得注意的是，既往的臨床研究表明近側(cè)胃癌的預(yù)后比遠(yuǎn)側(cè)胃癌差［24］，而我們的研究也表明5-FU及5-FU+OX的化療敏感性在遠(yuǎn)側(cè)部胃癌中較高，這是否與臨床預(yù)后相關(guān)也有待進(jìn)一步驗證。

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