殼聚糖聚乳酸羥基乙酸納米粒子作為抗瘤藥物載體的研究*

馬方奎，包子?jì)梗愇鲝V

（中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003）

近年來(lái)，阿霉素作為廣譜抗腫瘤藥物，常用于多種癌癥的治療，其對(duì)乳腺癌也具有很好的治療效果［1］，但是由于腫瘤多藥耐藥性的存在，影響了阿霉素的抗腫瘤效果。目前針對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞系來(lái)研究解決多藥耐藥性的報(bào)道已經(jīng)很多，而納米靶向載體成為克服腫瘤多藥耐藥性和提高藥物靶向的一個(gè)重要途徑。Bae等［2］的研究表明，通過(guò)納米載體包載阿霉素進(jìn)行藥物釋放，可以顯著降低阿霉素的毒性和副作用。

聚乳酸羥基乙酸（PLGA）作為FDA認(rèn)可的生物醫(yī)用材料已經(jīng)被用于大量的臨床試驗(yàn)，已經(jīng)成功用于多種抗腫瘤化療藥物（尤其是疏水藥物）的載體進(jìn)行給藥。De等［3］研究利用PLGA包載抗癌藥物紫杉醇，可以顯著增加藥物在4T1腫瘤細(xì)胞中的攝取和抑制作用。然而PLGA包載的納米載藥粒子被細(xì)胞吞噬系統(tǒng)的快速吞噬，很大程度上影響了PLGA載藥納米粒子的靶向效果。因此PLGA納米載藥運(yùn)輸?shù)淖畲蟮膯?wèn)題是如何有效規(guī)避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬（Reticuloendothelial system，RES）。而這可以通過(guò)親水聚合物的表面修飾來(lái)改變納米粒子表面的親水性，從而降低納米粒子表面對(duì)調(diào)理素的吸收，而且減少巨噬細(xì)胞的吞噬，提高載藥的靶向性［4］。利用殼聚糖修飾PLGA納米粒子后，進(jìn)一步用親水性的PEG包被修飾來(lái)改變納米粒子表面的親水性，以降低細(xì)胞表面對(duì)調(diào)理素的吸收從而提高靶向性。Hu等［5］報(bào)道，無(wú)毒且生物相容性好的陽(yáng)離子聚合物殼聚糖可以促進(jìn)納米粒子穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，親水性的PEG也被引入額外包被在納米粒子表面提高親水性。

因此，利用殼聚糖與PLGA的共價(jià)連接，通過(guò)PLGA納米粒子表面殼聚糖的引入來(lái)減輕異物排斥反應(yīng)，降低巨噬細(xì)胞對(duì)疏水納米粒子的吞噬成為提高載藥納米靶向性的新途徑。本文以人乳腺癌細(xì)胞MCF-7作為培養(yǎng)細(xì)胞，阿霉素作為抗癌藥物，來(lái)研究載藥殼聚糖PLGA納米載體對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，同時(shí)對(duì)比傳統(tǒng)方法合成的PLGA納米載體和殼聚糖表面修飾PLGA得到的納米載體（C-NPs），對(duì)自組裝的殼聚糖PLGA納米載體（G-NPs）作為新型納米抗癌藥物載體用于腫瘤細(xì)胞抑制的定性和定量研究，通過(guò)熒光觀(guān)察腫瘤細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取情況，進(jìn)而評(píng)價(jià)G-NPs作為新型納米載體在腫瘤治療方面的應(yīng)用。

1 材料

1.1 藥品與試劑

殼聚糖（chitosan，CHS，26kDa，DD＝90%），購(gòu)自山東恒臺(tái)縣金湖甲殼制品有限公司；端羧基聚乳酸羥基乙酸（poly（lactic-co-glycolic acid，PLGA，50/50，Mv＝5 000，購(gòu)自山東省醫(yī)療器械研究所；異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）購(gòu)自Sigma公司；冰醋酸、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等其他試劑均為分析純；人乳腺癌細(xì)胞MCF-7由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要儀器設(shè)備

VCX 105型超聲儀（美國(guó)Uibra公司）；HealForce 90二氧化碳培養(yǎng)箱（河南兄弟儀器設(shè)備有限公司）；UV-1601紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；Biotek Synergy2多功能熒光酶標(biāo)儀（美國(guó)Bioteck公司）；XDS-1倒置顯微鏡（南京米厘特精密儀器有限公司）；BX51熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 空白及載藥納米載體的制備

空白PLGA納米粒子的制備參照 Wang等［6］的方法，具體步驟如下：首先，稱(chēng)取100mg PLGA溶解于5mL二氯甲烷中，然后逐滴加入到含0.5%（w/v）PVA的去離子水中，磁力攪拌器持續(xù)攪拌形成初乳，然后用超聲均質(zhì)機(jī)以800r/min超聲10min，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸掉有機(jī)溶劑得到PLGA納米分散體系，以15 000r/min離心10min，去離子水洗滌3次，重復(fù)離心得到的產(chǎn)物凍干備用。

表面修飾的殼聚糖-PLGA納米載體（C-NPs）的制備：稱(chēng)取100mg制得的PLGA納米粒子分散于5mL MES緩沖液中（pH＝5.0），加入一定量的1－乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化反應(yīng)一定時(shí)間，然后將50mL配置好的0.2%（w/v）殼聚糖溶液加入以上反應(yīng)體系，室溫下攪拌反應(yīng)48h，15 000r/min離心10 min后冷凍干燥得到產(chǎn)物C-NPs。在乳化前，將一定量阿霉素預(yù)溶于油相二氯甲烷中，即得載阿霉素的PLGA納米粒子和C-NPs。

自組裝的殼聚糖-PLGA納米載體（G-NPs）的制備：稱(chēng)取100mg PLGA溶解于5mL的二氯甲烷中，將以上溶液滴加入含一定量EDC和NHS的5mL MES緩沖液中（pH＝5.0）冰浴下活化1.5h，然后將50mL配置好的0.2% （w/v）殼聚糖溶液加入到以上反應(yīng)體系，室溫下攪拌反應(yīng)48h，旋蒸掉有機(jī)溶劑，過(guò)濾后以去離子水透析48h去除過(guò)量反應(yīng)底物，冷凍干燥制得聚合物。稱(chēng)取一定量制備得到的聚合物分散于去離子水中，在冰浴條件下以超聲儀超聲3min（超聲間隔，超3s停2s，功率30%），得到的樣品溶液以0.8μm濾膜過(guò)濾后冷凍干燥，即得G-NPs。

載藥G-NPs的制備參照Hyung等［7］的方法，將一定量阿霉素分散于PBS中（pH＝7.4），加入制備得到的聚合物，超聲制備得到包載DOX的G-NPs，實(shí)驗(yàn)過(guò)程避光，制得樣品凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 FITC標(biāo)記的空白納米粒子FITC-C-NPs和FITCG-NPs的制備

分別稱(chēng)取40mg精制的C-NPs和G-NPs超聲分散于20mL去離子水中，用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5。稱(chēng)取FITC 4mg溶于4mL無(wú)水甲醇中，逐滴加入到含CP和GP的去離子水中，室溫避光反應(yīng)6h后，向反應(yīng)體系中加入48mL的甲醇/氨水（v/v，7∶3）的混合液，8 000×g離心10min，棄上清液，所得沉淀用甲醇洗滌至濾液在495nm下無(wú)熒光吸收為止。冷凍干燥后得黃色目標(biāo)產(chǎn)物。

2.3 MCF-7細(xì)胞對(duì)納米粒攝取的定量測(cè)定

MCF-7細(xì)胞對(duì)熒光納米粒攝取的定量測(cè)定參照Khin等［8］的方法：取指數(shù)生長(zhǎng)期 MCF-7細(xì)胞，用胰酶消化后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上（100μL/孔，接種密度為3×104個(gè)/mL），在37℃、5%CO2、95%濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)成單層，吸出原培養(yǎng)液，用5mL D-Hank’s緩沖液于培養(yǎng)箱中平衡培養(yǎng)30min，吸除D-Hank’s后，加入不同濃度的以D-Hank’s配置的熒光納米懸液（FITC-C-NPs 和FITC-G-NPs），納米懸液濃度分別為：25，50，100，200，400和800μg/mL，于二氧化碳培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1，2和4h后，將熒光納米粒懸液吸出，以PBS緩沖液（pH＝7.4）輕輕漂洗3次除去游離納米粒，每孔加入100μL 0.5%的Triton X－100細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞30min，最后于熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)分離得到的細(xì)胞裂解液的熒光強(qiáng)度（λex＝485nm，λem＝528nm）。其中未處理的空白細(xì)胞作為對(duì)照，參照FITC標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算細(xì)胞中的FITC含量，最后根據(jù)公式（1）計(jì)算 MCF-7細(xì)胞對(duì)2種不同濃度的熒光納米粒子的攝取效率（Cellular Uptake Efficiency）：

其中：WF為不同濃度熒光納米粒子處理得到的細(xì)胞裂解液中FITC的含量；WS為不同濃度熒光納米粒子中FITC的總含量。

2.4 細(xì)胞吞噬熒光納米粒的顯微鏡觀(guān)察

MCF-7細(xì)胞對(duì)FITC-C-NPs和 FITC-G-NPs兩種納米粒的攝取參照Z(yǔ)hang等［9］的方法，取傳代至指數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞用0.25%胰酶細(xì)胞消化后，分別取1mL/孔接種到6孔培養(yǎng)板中（接種密度為3×104個(gè)/mL），在37℃、5%CO2、95%濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)成單層，每孔加入一定濃度的 FITC-C-NPs和 FITC-G-NPs納米粒溶液，分別于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1和4h，培養(yǎng)完成后，用pH＝7.4的PBS緩沖液小心漂洗細(xì)胞3次，于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察并拍照。

2.5 載藥納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的定量測(cè)定

DOX，DOX-PLGA NPs，DOX-C-NPs和 DOX-GNPs對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的定量測(cè)定，作者采取MTT法［10］：取指數(shù)生長(zhǎng)期 MCF-7細(xì)胞，用1mL 0.25%胰酶消化后，加入10mL新鮮培養(yǎng)液（DMEM高糖培養(yǎng)基，10%胎牛血清），取100μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上（接種密度3×104個(gè)/mL），在37℃、5%CO2、95%濕度的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，至MCF-7細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)成單層后，吸出原培養(yǎng)液，每孔加入不同藥物濃度的3種載藥納米粒溶液（DOX-PLGA NPs、DOX-C-NPs和DOX-G-NPs）和游離阿霉素（200μL/孔，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行），用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間。每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液反應(yīng)，繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，使結(jié)晶物充分融解，終止反應(yīng)，恒溫振蕩反應(yīng)10min后，在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定培養(yǎng)板各組樣品的吸光度值，按公式（2）計(jì)算載藥納米粒對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的相對(duì)抑制率（Inhibitory rate of control，IR%）：

其中：ODC為陰性對(duì)照組的吸光度值；ODS為樣品處理組的吸光度值。

3 結(jié)果與討論

3.1 3種納米載體的合成

經(jīng)乳化方法制備的空白PLGA NPs為圓球形（見(jiàn)圖1）；C-NPs形成的是以PLGA納米球?yàn)楹诵牡谋砻姘粴ぞ厶堑慕Y(jié)構(gòu)；G-NPs則是通過(guò)鏈與鏈間共價(jià)接枝聚合，在超聲作用下自組裝而成的結(jié)構(gòu)均一的納米粒子。顯然對(duì)比C-NPs與G-NPs，兩者雖然都是殼聚糖和PLGA通過(guò)酰胺鍵共價(jià)連接而成，但由于合成路線(xiàn)和成球方法的差別，兩者具有不同的納米結(jié)構(gòu)，而作為納米載體的納米結(jié)構(gòu)的影響，則可通過(guò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，藥物包載和釋放，細(xì)胞吞噬效率等研究來(lái)分析。

3.2 MCF-7細(xì)胞對(duì)熒光納米粒攝取的定量測(cè)定

圖1 3種納米載體的合成Fig.1 Schematic representation of three differently structured nanoparticles

制備得到的不同濃度C-NPs和G-NPs 2種熒光標(biāo)記納米粒子在MCF-7細(xì)胞中孵育1h后，細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取情況見(jiàn)圖2，隨著納米粒子濃度從25μg/mL升高到400μg/mL，MCF-7細(xì)胞對(duì)2種熒光納米粒的攝取效率逐漸增加，呈一定的濃度依賴(lài)性，C-NPs和GNPs 2種納米粒在細(xì)胞孵育1h后的熒光攝取效率沒(méi)有明顯差異；而當(dāng)納米粒子的濃度增加到800μg/mL時(shí)，細(xì)胞對(duì)熒光納米粒的攝取效率開(kāi)始出現(xiàn)下降，CNPs和G-NPs分別從400μg/mL濃度時(shí)的6.74%和6.92%，下降到800μg/mL濃度時(shí)的5.36%和5.24%。

圖2 孵育1h后MCF-7細(xì)胞對(duì)2種不同濃度納米粒子的細(xì)胞攝取效率Fig.2 Cellular uptake efficiency of different concentration nanoparticles by MCF-7cells after 1hincubation

研究表明，細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取主要受納米粒子的濃度、表面電荷、粒徑、形狀及表面修飾基團(tuán)理化性質(zhì)的 影 響［11－12］，MTT實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，C-NPs和 GNPs由于殼聚糖的修飾作用，其相對(duì)細(xì)胞毒性高于PLGA納米粒子，表明殼聚糖的修飾增加了納米粒子對(duì)細(xì)胞的黏附作用。殼聚糖主鏈上活性氨基基團(tuán)質(zhì)子化后，通過(guò)與細(xì)胞膜表面負(fù)電蛋白的非特異性靜電吸附而促進(jìn)粒子與細(xì)胞的黏附，當(dāng)納米粒子到達(dá)細(xì)胞膜后，再通過(guò)細(xì)胞膜上親水基團(tuán)或疏水基團(tuán)與納米粒子之間的相互作用，細(xì)胞膜內(nèi)陷包裹納米粒子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。Guan等［13］和 Pamujula等［14］報(bào)道殼聚糖親水性和氨基陽(yáng)離子有助于細(xì)胞對(duì)納米粒子的黏附，這種黏附作用隨著納米粒子濃度的增加而提高。納米粒子的表面親水性降低了巨噬細(xì)胞吞噬系統(tǒng)對(duì)納米粒子的吞噬，進(jìn)一步增加細(xì)胞對(duì)納米粒子的有效黏附和攝取效率［15］。

因此低濃度條件下（25～400μg/mL），納米粒子表面的親水性和表面電荷促進(jìn)了MCF-7細(xì)胞對(duì)2種納米粒子的黏附作用，細(xì)胞對(duì)2種納米粒子的攝取都呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性，隨濃度的升高而增大，而當(dāng)納米粒濃度增大至800μg/mL時(shí)，細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取量逐漸趨近飽和，導(dǎo)致了細(xì)胞相對(duì)攝取效率下降。

圖3 孵育不同時(shí)間后MCF-7細(xì)胞對(duì)濃度為200μg/mL的2種納米粒的細(xì)胞攝取效率Fig.3 Cellular uptake efficiency of different nanoparticles by MCF-7cells incubated for different times with a particle concentration of 200μg/mL

為了進(jìn)一步研究MCF-7細(xì)胞對(duì)熒光納米粒子攝取隨時(shí)間變化的關(guān)系，以濃度為200μg/mL的C-NPs和G-NPs分別孵育細(xì)胞1、2、4h后，測(cè)定 MCF-7細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取效率（見(jiàn)圖3）。MCF-7細(xì)胞對(duì)CNPs和G-NPs的攝取也呈現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞攝取效率逐漸增加，C-NPs從1h的3.59%升高到了4h后的7.33%；G-NPs從1h時(shí)的3.71%升高到了4h后的7.51%。

通過(guò)測(cè)定MCF-7細(xì)胞對(duì)C-NPs和G-NPs攝取效率隨濃度和時(shí)間變化的關(guān)系，說(shuō)明自組裝合成的GNPs與傳統(tǒng)方法制備得到C-NPs相比，由于2種納米粒子的表面結(jié)構(gòu)和性質(zhì)存在差異，在表面親水性殼聚糖和活性氨基的作用下，其細(xì)胞吞噬效率在4h內(nèi)未表現(xiàn)出明顯差別，MCF-7細(xì)胞對(duì)2種納米粒子的攝取，在濃度為25～400μg/mL，孵育1～4h的條件下，攝取效率具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性。

3.3 細(xì)胞攝取熒光納米粒的顯微鏡觀(guān)察

MCF-7細(xì)胞對(duì)2種空白熒光標(biāo)記納米粒子攝取情況的熒光顯微鏡照片見(jiàn)圖4，A/B為FITC-C-NPs組；C/D為FITC-G-NPs組；A/C為顯微鏡光源下熒光未激發(fā)的細(xì)胞形態(tài)照片、B/D為熒光藍(lán)色通道激發(fā)FITC后的顯色照片；細(xì)胞孵育熒光納米粒1h后，即可看到2種FITC標(biāo)記的納米粒子已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（呈綠色熒光標(biāo)記），細(xì)胞對(duì)2種納米粒子的攝取情況無(wú)明顯差異，與定量測(cè)定的結(jié)果相一致。

圖4 熒光倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞對(duì)納米粒子攝取Fig.4 Fluorescence microscopic images of different nanoparticles with MCF-7cells

為了觀(guān)察C-NPs和G-NPs 2種納米粒子細(xì)胞攝取孵育時(shí)間的變化，同時(shí)觀(guān)察包載藥物阿霉素后，MCF-7細(xì)胞對(duì)納米藥物載體的攝取分布情況，作者制備了FITC標(biāo)記的包載阿霉素的2種納米粒子：FITC-DOXC-NPs和FITC-DOX-G-NPs，在 MCF-7細(xì)胞孵育4h后，通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察納米粒子和藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，見(jiàn)圖5，A/B為 FITC-DOX-C-NPs組；C/D為FITC-DOX-GNPs組；A/C 為熒光綠色通道激發(fā)DOX后的顯色照片（紅色）、B/D為熒光藍(lán)色通道激發(fā)FITC后的顯色照片（綠色）；可以明顯看出包載藥物的納米粒子已經(jīng)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入到了細(xì)胞膜內(nèi)，DOX和FITC呈現(xiàn)相同的標(biāo)記位置，證明熒光標(biāo)記的載藥納米粒子成功進(jìn)入到了細(xì)胞內(nèi)。FITC-DOX-CNPs和 FITC-DOX-G-NPs 2種納米粒子在孵育4h后，在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量明顯增加（對(duì)比圖4），結(jié)合定量測(cè)定的結(jié)果，進(jìn)一步說(shuō)明MCF-7細(xì)胞對(duì)2種納米粒子的攝取具有時(shí)間依賴(lài)性。而且細(xì)胞在孵育1和4h后，細(xì)胞對(duì)2種納米粒子的吞噬情況無(wú)明顯差異。

圖5 孵育4h后MCF-7細(xì)胞對(duì)2種載藥納米粒子的細(xì)胞攝取Fig.5 Fluorescence microscopic images of different nanoparticles with MCF-7cells incubated for 4h

3.4 載藥納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的定量測(cè)定

通過(guò)MCF-7細(xì)胞對(duì)空白熒光納米粒攝取的定量測(cè)定和觀(guān)察，證明了經(jīng)殼聚糖修飾的2種納米粒子CNPs和G-NPs可以有效的被細(xì)胞吞噬，然而藥物包載后，經(jīng)殼聚糖修飾的載藥納米粒子藥物釋放效果的評(píng)價(jià)，則需要進(jìn)一步通過(guò)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制來(lái)進(jìn)行測(cè)定。

圖6為3種載藥納米粒子對(duì)比游離DOX在細(xì)胞孵育12h后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨藥物濃度變化的情況。PLGA、C-NPs、G-NPs和游離藥物對(duì) MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率都隨著藥物濃度的增加而增加，在低濃度條件下（1～4μg/mL），3種載藥納米粒子的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率基本都要高于游離藥物組，而當(dāng)藥物濃度從8μg/mL上升到16μg/mL時(shí)，游離藥物的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率快速升高（16μg/mL，58.77%），超過(guò)了3種載藥納米粒子（16μg/mL PLGA 33.07%；C-NPs 39.66%；GNPs 40.05%），說(shuō)明在較低藥物濃度下，通過(guò)納米藥物載體的靶向性和細(xì)胞吞噬增加了細(xì)胞對(duì)納米藥物載體的攝取，而納米載體對(duì)P-gp主導(dǎo)的MDR效應(yīng)的削弱進(jìn)一步提高了細(xì)胞內(nèi)藥物的有效濃度，而游離阿霉素在較低濃度下，無(wú)法形成較高的滲透壓，而導(dǎo)致藥物擴(kuò)散作用相對(duì)較弱，而且藥泵P－gp的作用和溶酶體的吞噬溶解，進(jìn)一步降低了游離藥物在細(xì)胞內(nèi)的積聚；而隨著藥物濃度的升高（16μg/mL），游離藥物的擴(kuò)散作用增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)游離阿霉素的濃度迅速增加，而納米載體藥物的緩釋性使得在12h的孵育條件下，高濃度的游離藥物明顯高于包載藥物的納米載體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

圖6 孵育12h載藥納米粒對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率Fig.6 Inhibitory rate of drug-loaded nanoparticles to MCF-7cells incubated for 12h

同時(shí)在12h孵育條件下，3種納米藥物載體中，CNPs和G-NPs在不同的藥物濃度下均表現(xiàn)出比PLGA NPs高的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，這主要是由于C-NPs和GNPs納米載體表面殼聚糖親水性基團(tuán)和正電性氨基的存在，使得這2種納米藥物載體的靶向性和細(xì)胞黏附效率明顯增加，從而表現(xiàn)出相對(duì)于PLGA納米載體更好的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效果。而在12h孵育條件下，未觀(guān)察到C-NPs和G-NPs的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制差異。

4 結(jié)語(yǔ)

以人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為模型細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記納米載體的攝取和生長(zhǎng)抑制情況進(jìn)行了研究，殼聚糖修飾的2種納米粒子C-NPs和G-NPs表現(xiàn)出良好的細(xì)胞靶向性，通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察，均能有效的被MCF-7細(xì)胞攝取，而2種殼聚糖修飾的納米載體的攝取效率無(wú)顯著差異。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的定量測(cè)定表明，由于殼聚糖的靶向作用，載藥后C-NPs和G-NPs在低藥物濃度1～4μg/mL時(shí)，具有優(yōu)于游離阿霉素和載藥PLGA納米載體的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，另外載藥納米載體對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制具有一定的時(shí)間和濃度依賴(lài)性。結(jié)果表明，G-NPs包載疏水抗癌藥物后，有潛力成為抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的新型納米載體。

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