液質(zhì)聯(lián)用快速測(cè)定河鲀魚(yú)肝臟中河鲀毒素含量的方法研究*

曹文卿，林黎明，時(shí) 迪，楊桂朋**

（1.中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266100；2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東 青島 266002）

河鲀魚(yú)不僅味極鮮美，亦是一味珍貴中藥；能補(bǔ)虛、去濕、理腰腳、去痔、殺蟲(chóng)；去疳、消腫，宋《開(kāi)寶本草》、明《本草蒙筌》皆有記載。其藥用價(jià)值源自其含有的微量劇毒河鲀毒素（Tetrodotoxin，TTX），是毒性極大的一種小分子海洋毒素，LD50為8.7μg/kg，為氰化鈉的1 000倍。毒性作用主要表現(xiàn)為阻遏神經(jīng)和肌肉的鈉離子傳導(dǎo)，致死率高達(dá)60%［1］。野生河鲀魚(yú)幾乎普遍含毒，養(yǎng)殖品種則因食源不同低毒或無(wú)毒，肝臟是其毒性大小的標(biāo)志性器官。在嚴(yán)格控制TTX劑量的前提下，含毒河鲀魚(yú)肝臟可用作鎮(zhèn)痛、戒毒的藥材；除毒后的河鲀肝油亦可作為提高人體免疫力的保健食品；適量為良藥，過(guò)量則奪命。因此從食品安全和毒性控制方面考慮，快速準(zhǔn)確測(cè)定河鲀魚(yú)肝臟中TTX含量具有重要意義。而TTX微溶于水，可溶于弱酸水溶液；溶液酸度對(duì)其穩(wěn)定性影響大，pH值＞7和pH值＜3時(shí)均易分解；220℃以上炭化［2－3］。目前 TTX的測(cè)定方法主要有生物檢測(cè)法（小鼠法）、酶聯(lián)免疫［4－5］、電化學(xué)法（毛細(xì)管電泳法）、色譜法（包括液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用）等［6－9］。但酶聯(lián)免疫法成本高，小鼠法因小鼠個(gè)體差異影響測(cè)定值的準(zhǔn)確性；液相色譜－熒光檢測(cè)以及氣相－質(zhì)譜方法需將TTX堿解衍生，步驟復(fù)雜、耗時(shí)，源自樣品的熒光物質(zhì)干擾也影響檢測(cè)結(jié)果。而液質(zhì)聯(lián)用方法，樣品前處理凈化要求高，多采用乙酸水、三氯乙酸等溶液提取，樣品凈化需經(jīng)過(guò)固相萃?。ㄈ鏑18小柱、離子交換柱、石墨化炭黑小柱等）［9－12］和超濾等手段［13－14］，成本高且耗時(shí)，最終所得提取液仍存在嚴(yán)重基質(zhì)效應(yīng)；為增強(qiáng)TTX在色譜柱上的保留在流動(dòng)相中加入七氟丁酸［15］；劉希等建立了液相色譜－飛行時(shí)間質(zhì)譜方法，陽(yáng)離子交換－反相混合色譜柱測(cè)定人血漿中河鲀毒素，但檢測(cè)限較高（250μg/L），僅能用于測(cè)定河鲀魚(yú)樣品中mg/L水平的河鲀毒素［16］。本文建立一種快速測(cè)定河鲀魚(yú)肝臟樣品中河鲀毒素的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，采用酸解超聲提取，采用正己烷脫脂和QuEChERS［17］（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）方法配制合適吸附劑凈化樣液，離心過(guò)濾后直接進(jìn)樣分析（節(jié)省濃縮時(shí)間），流動(dòng)相不使用離子對(duì)試劑，前處理過(guò)程簡(jiǎn)捷、節(jié)約。定性定量準(zhǔn)確，方便實(shí)用，適用于河鲀魚(yú)肝臟中河鲀毒素的快速檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），6410MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)器（Agilent公司），配有電噴霧離子源（ESI）；電子分析天平（XS 205，0.1mg，瑞士Mettoler toledo公司）；高速冷凍離心機(jī)（CR22GⅢ，日本日立公司）；渦旋混勻器（IKA3，德國(guó)IKA公司）；均質(zhì)器（IKA T25）；組織粉碎機(jī)；KQ-500DB超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

河鲀毒素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，百靈威科技公司）；乙酸、乙酸銨（≥99%，F(xiàn)luka公司），乙腈、甲醇、正己烷（色譜純，德國(guó)Merk公司），石墨化碳黑（Cleanert pesticarb，120～400目）、丙基乙二胺吸附劑（PSA）和十八烷基鍵合硅膠（C18，40μm）吸附劑（天津博納艾杰爾公司），0.22μm聚四氟乙烯－尼龍復(fù)合濾膜（Waters公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q處理水（美國(guó)Millipore公司）。

精確稱取河鲀毒素標(biāo)準(zhǔn)品用純水溶解并定容，配制成濃度為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（－20℃保存）。儲(chǔ)備液進(jìn)一步用純水稀釋成10mg/L的中間溶液。提取液：1%乙酸甲醇（1∶99，V/V）溶液（pH＝3.8）。

1.2 樣品預(yù)處理

（a）鮮河鲀魚(yú)冷凍處死，小心取其肝臟部分，經(jīng)均質(zhì)制樣機(jī)充分粉碎；陰性樣品于2012年3月取自威海人工養(yǎng)殖紅鰭東方鲀；陽(yáng)性肝臟來(lái)自2012年5月青島沙子口漁碼頭收購(gòu)的野生暗紋東方鲀。

（b）準(zhǔn)確稱取上述試樣（1.00±0.01）g于50mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入5mL 1%乙酸甲醇，均質(zhì)30s后于50℃下超聲提取30min。8 000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈聚丙烯離心管中；殘?jiān)尤?mL 1%乙酸甲醇，重復(fù)提取1次，合并上清液，將合并后的上清液4℃下12 000r/min離心5min，取1.5 mL加入5mL正己烷，劇烈渦旋混勻30s后4℃12 000r/min離心5min，棄正己烷層，重復(fù)脫脂1次，所得清液待凈化。

（c）取上步上清液1.0mL于2mL EP（Eppendorf）管中，加入100mg C18粉和100mg石墨化碳黑（GCB）粉末劇烈渦旋混合30s，10 000r/min離心5min，上層清液過(guò)0.22μm聚PTFE－尼龍復(fù)合濾膜，收集于棕色進(jìn)樣小瓶中待測(cè)。

1.3 色譜－質(zhì)譜條件

河鲀毒素的分子式為C11H17O8N3，相對(duì)分子質(zhì)量為319.27，是一種氨基過(guò)氫喹唑啉化合物，其結(jié)構(gòu)呈籠狀如圖1所示，包括1個(gè)碳環(huán)、1個(gè)胍基、6個(gè)羥基和1個(gè)半縮醛內(nèi)酯官能團(tuán)，因而其極性較強(qiáng)，在酸性條件下易發(fā)生質(zhì)子化，在正離子模式下（［M＋H］＋）靈敏度遠(yuǎn)高于負(fù)離子模式（［M－H］－），故選擇ESI源和酸性流動(dòng)相，氨基色譜柱正離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。

圖1 河鲀毒素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of tetrodotoxin

1.3.1 色譜條件 TSK-gel Amide-80色譜柱（3μm，150mm×2.0mm（i.d.））；流動(dòng)相 A：乙腈；流動(dòng)相B：水（0.15% 乙 酸，V/V，含 10mmol/L 乙 酸 銨，pH＝4.4）。流速及洗脫梯度見(jiàn)表1（柱平衡時(shí)間5min）；進(jìn)樣量：5μL；柱溫：35℃。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度Table 1 The gradient elution procedures of tetrodotoxin

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI＋）；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：正3 500V；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量：10L/mL；霧化器壓力：45psi；TTX的質(zhì)譜定性定量信息見(jiàn)表2，液相轉(zhuǎn)向閥時(shí)間分割參數(shù)等見(jiàn)表3。

表2 河鲀毒素的HPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)Table 2 The HPLC-MS/MS parameters of tetrodotoxin in multiple reaction monitoring（MRM）

表3 TTX的液相轉(zhuǎn)向閥分割參數(shù)Table 3 The time segments of diversion valve of HPLC for tetrodotoxin

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

分別選用甲醇∶乙腈（v/v＝1∶1）-0.1%甲酸水溶液、甲醇-5mmol/L的乙酸銨水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.15%的乙酸水溶液（含10mmol/L乙酸銨）乙腈-0.1%的甲酸水溶液（含10mmol/L的乙酸銨）為流動(dòng)相。并進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，在該儀器條件下，以乙腈-0.1%的甲酸水溶液（含10mmol/L的乙酸銨）和乙腈-0.15%的乙酸水溶液（含10mmol/L乙酸銨）時(shí)，采用2.3.1（見(jiàn)表1）的梯度程序，TTX與雜質(zhì)均能得到較好分離，且保留時(shí)間適宜（11.6min附近），待測(cè)樣品中化合物色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比變化范圍在±0.25min之內(nèi)），各基質(zhì)總離子流圖（見(jiàn)圖2）與陽(yáng)性河鲀魚(yú)肝臟樣品提取液質(zhì)譜圖中無(wú)明顯干擾峰（見(jiàn)圖3）。差異在于，用乙酸銨作緩沖鹽時(shí)比用甲酸銨峰形好，且濃度增大利于TTX峰形尖銳，但高濃度的乙酸銨會(huì)使質(zhì)譜靈敏度下降，影響儀器耐用性，綜合考慮，選用乙腈-0.15%的乙酸水溶液（含10 mmol/L乙酸銨）作為流動(dòng)相。

圖2 TTX標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖與提取離子流圖Fig.2 MS spectrum TIC and EIC of tetrodotoxin

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

從質(zhì)譜全掃描得到TTX的一級(jí)質(zhì)譜圖，分子離子為320.2；以分子離子為母離子進(jìn)行子離子掃描，得到相應(yīng)子離子：302.2、162.1、284.0；選取最強(qiáng)的2個(gè)子離子302.2、162.1，并將豐度最高的離子對(duì) 320.2/302.2用以定量。優(yōu)化碎裂電壓（Fragmentor）和碰撞能（CE）（優(yōu)化的參數(shù)見(jiàn)表2）。

圖3 TTX陽(yáng)性河鲀魚(yú)肝臟樣品（TTX含量1 165.7μg/kg）中TTX總離子流圖及提取離子流圖Fig.3 TIC ＆ EIC of MS Spectrum of tetrodotoxin in wild fugu liver sample（TTX 1 165.7μg/kg）

2.3 提取與凈化方法的改進(jìn)

2.3.1 提取液的選擇 分別以9mL 5種不同提取液（a：提取液1%乙酸乙腈－甲醇1.0%acetic acid acetonitrile methonal（1∶75∶24，V/V）；b：提取液0.2%乙酸乙醇0.2%acetic acid methonal（1∶499，V/V）；c：提取液1%乙酸乙醇1.0%acetic acid methonal（1：99，V/V）；d：提取液1.5%乙酸乙醇1.5%acetic acid methonal（1.5∶98.5，V/V）；e：提取液2.0%乙酸乙醇2.0%acetic acid methonal（1∶49，V/V））對(duì)河鲀魚(yú)肝臟樣品（1.00g）進(jìn)行提取，得到TTX的加標(biāo)回收率（見(jiàn)圖4）。由圖4（A）可見(jiàn)，提取液c對(duì)河鲀魚(yú)肝臟中河鲀毒素的加標(biāo)回收率最高（95.2%）；提取液d，e稍次之，提取液b回收率為71%；提取液a最低，不到55%.表明：（1）乙酸甲醇對(duì)TTX的提取能力優(yōu)于乙酸乙腈甲醇溶液；（2）乙酸甲醇溶液中乙酸濃度影響對(duì)目標(biāo)物的提取效率（低于1%時(shí)，提取能力太低；而高于1%時(shí)提取能力不隨酸度增大而增強(qiáng)），因此本實(shí)驗(yàn)采用c溶液作為T(mén)TX提取溶劑。同時(shí)考察在50℃下超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響（見(jiàn)圖4（B）），提取時(shí)間從10～25min之間變化時(shí)，TTX回收率隨超聲時(shí)間增加而增大，但時(shí)間超過(guò)30min以后回收率趨于穩(wěn)定；鑒于河鲀毒素的熱不穩(wěn)定性，因而將實(shí)驗(yàn)條件定為50℃超聲25min，避免提取過(guò)程中TTX發(fā)生降解。

2.3.2 吸附劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別選擇（1）N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）；（2）GCB；（3）GCB和PSA；（4）農(nóng)殘吸附劑fatty；（5）農(nóng)殘吸附劑pigment；（6）中性氧化鋁吸附劑（Al2O3－N）；（7）C18＋GCB；（8）C18＋PSA；（9）C18＋PSA＋GCB；（10）硅藻土（Diatomite）；（11）C18；（12）硅鎂型吸附劑（Florisil，60～100目）；（13）C18＋Diatomite；和（14）GCB＋Diatomite作為分散固相萃取吸附劑，在2.3.1提取溶劑c中添加TTX標(biāo)準(zhǔn)，比較了不同吸附劑及其組合在提取溶劑c環(huán)境中對(duì)TTX回收效果的影響（見(jiàn)圖6A）。

圖4 不同類(lèi)型提取液（A）和超聲提取時(shí)間（B）對(duì)TTX回收率的影響Fig.4 Effects of different types of exacted solutions（A）＆times of ultrasonic extraxtion（B）on recoveries of tetrodotoxin

圖5 3種典型提取溶劑提取河鲀魚(yú)肝臟樣品中TTX總離子流圖Fig.5 TIC of 3types of exacted solutions for tetrodotoxin in fugu liver samples

從圖6（A）可見(jiàn)，C18、GCB以及二者混合物作為QuEChERS吸附劑時(shí)，TTX回收率在84%以上，單用硅藻土、硅藻土與C18、硅藻土與GCB的混合物時(shí)回收率則分別為60%、79%和68%；硅鎂型材料、農(nóng)殘除脂和脫色素材料分別得到27%和23%；而PSA的組合以及中性氧化鋁作吸附劑TTX回收率均低于5%；原因在于GCB表面碳原子間均為具有單電子對(duì)和活潑離子的SP2雜化，其六邊形微觀結(jié)構(gòu)，對(duì)平面分子及含平面芳香環(huán)的分子具有強(qiáng)吸附作用，能去除具有共軛結(jié)構(gòu)的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸等雜質(zhì)；GCB表面總體憎水，可吸附非極性與弱極性化合物；次表面存在的極性位點(diǎn)使之能夠吸附極性化合物或作為離子交換劑［18－23］，因此表現(xiàn)為可同時(shí)吸附非極性、弱極性以及極性化合物的廣譜吸附性能；在本實(shí)驗(yàn)采用的提取環(huán)境中可吸附河鲀魚(yú)風(fēng)味成分精氨酸、谷氨酸、天門(mén)冬酸等；C18也是一種廣譜性非極性凈化劑，能夠針對(duì)非極性雜質(zhì)進(jìn)行有效提??；而硅藻土吸附雜質(zhì)是篩分、深層過(guò)濾、分子間力、Zeta電位和離子交換作用的結(jié)果；PSA為弱陰離子交換劑，分子結(jié)構(gòu)含有2個(gè)氨基，可形成氫鍵或離子交換與有機(jī)酸及脂肪酸、糖類(lèi)等結(jié)合，也能吸附TTX，因而回收率較低［24］。考慮到河鲀魚(yú)肝臟提取液含有豐富的極性和非極性的風(fēng)味成分不飽和脂肪酸、微蛋白類(lèi)等化學(xué)成分［25］，據(jù)圖6A實(shí)驗(yàn)結(jié)果知C18，GCB為可選凈化吸附劑，于是在加標(biāo)河鲀魚(yú)肝臟提取液中進(jìn)一步考察凈化劑（a）：C18；（b）：GCB；（c）：C18＋GCB對(duì)實(shí)際樣品基質(zhì)雜質(zhì)的吸附效果；得到結(jié)果見(jiàn)圖6（B），從圖6（B）知，C18和GCB對(duì)吸附河鲀魚(yú)肝臟基質(zhì)提取液中的雜質(zhì)具有協(xié)同作用。綜合考慮，本方法采用C18和GCB作為QuEChERS凈化劑。本實(shí)驗(yàn)還考察了GCB用量對(duì)TTX回收率的影響（見(jiàn)圖6（C）），C18用量為100mg，GCB用量分別為30，50，100 mg時(shí)，TTX的回收率差別不大（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%），當(dāng)GCB用量從100mg增大到150mg時(shí)，質(zhì)譜圖信噪比（S/N）明顯增強(qiáng)（從53.7增大到79.7）；但TTX回收率卻下降3.4%。

圖6 不同吸附劑（A、B）和不同GCB用量對(duì)TTX回收率的影響（C）Fig.6 Effects of different dispersive sobents（A）and different amounts of GCB（B）on the recoveries of tetrodotoxin

2.4 方法的線性范圍

準(zhǔn)確稱取試樣（1.00±0.01）g于50mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入河鲀毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，使添加水平分別為0，30，40，0，100，500，1 000μg/kg，加蓋并混勻后放置0.5h；按照1.2（b），（c）程序處理，得到0，30，40，50，100，500，1 000μg/kg基質(zhì)校準(zhǔn)曲線；以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度（μg/kg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量測(cè)定，所得回歸參數(shù)（見(jiàn)表4）。結(jié)果表明，TTX在40～1 000μg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

表4 河鲀毒素在添加水平為40～1 000μg/kg時(shí)校準(zhǔn)曲線的相關(guān)參數(shù)Table 4 Calibration curve parameters in tetrodotoxin fortified fugu liver samples at range of 40～1000μg/kg

2.5 最低檢測(cè)限測(cè)定

稱取河鲀魚(yú)肝臟樣品1.00g（精確到0.01g），加入適量標(biāo)準(zhǔn)液，使樣品中TTX的濃度水平為30，40，50 μg/kg，每個(gè)水平有3個(gè)平行樣，按1.2（b），（c）程序處理后進(jìn)HPLC-MS/MS測(cè)定。添加水平為40μg/kg的提取液中的TTX的定性定量離子信噪比均＞3；添加水平為50μg/kg的溶液，測(cè)得TTX定量離子的S/N皆大于10（見(jiàn)表5），以被測(cè)化合物的響應(yīng)值信噪比≥3時(shí)所對(duì)應(yīng)的含量作為檢測(cè)限，信噪比大于10作為定量限；表明本方法中TTX的檢出限和定量限分別達(dá)到40和50μg/kg。

表5 TTX的檢出限測(cè)定參數(shù)Table 5 Signal-to-noise ratios in determination of tetrodotoxin in fugu liver samples by HPLC-MS/MS（spiked level at 40μg/kg（LOD）＆50μg/kg（LOQ））

2.6 方法的回收率和精密度

等量稱取18個(gè)（1.00±0.01）g陰性河鲀魚(yú)肝臟樣品于50mL聚丙烯離心管中，分為3組，分別加入適量標(biāo)準(zhǔn)工作液，使3組樣品中TTX的含量分別為50，75，100μg/kg，加標(biāo)樣品按步驟1.2（b），（c）處理后進(jìn)HPLC-MS/MS測(cè)定?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量，回收率和精密度數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。用空白基質(zhì)進(jìn)行回收率和室內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)，在添加水平為50，75，100 μg/kg時(shí)，TTX的平均回收率分別為83.0%～102%，79.2%～105.3%，89.3%～97.7%；TTX的總體變異系數(shù)分別為：8.6%，9.0%和3.4%。

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)13份河鲀魚(yú)肝臟樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中1?！?＃樣品為野生暗紋東方鲀肝臟（體長(zhǎng)分別為6.0，15.0，16.5cm），4?！?3＃肝臟樣品取自人工養(yǎng)殖紅鰭東方鲀（體長(zhǎng)11.5～25.5cm）。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果顯示，野生河鲀肝臟中TTX濃度遠(yuǎn)高于人工養(yǎng)殖品種，TTX含量與河鲀魚(yú)體形大小成一定比例關(guān)系。

圖7 空白以及加標(biāo)河鲀魚(yú)肝臟樣品總離子流圖Fig.7 TIC of blank and spiked fugu liver samples

表6 加標(biāo)河鲀魚(yú)肝臟樣品的平均回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝18）Table 6 The average recoveries and of precisions of tetrodotoxin in fortified fugu liver samples（n＝18）

表7 河鲀魚(yú)肝臟樣品中河鲀毒素含量實(shí)測(cè)值（n＝3）Table 7 Determined concentration of tetrodotoxin in fugu liver samples

3 結(jié)語(yǔ)

本文建立了快速檢測(cè)河鲀魚(yú)肝臟中TTX含量的高效液相色譜－質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測(cè)方法，樣品處理過(guò)程采用1%乙酸甲醇提取，樣品提取液經(jīng)正己烷脫脂以及C18和GCB混合吸附劑QuEChERS凈化后直接進(jìn)樣分析。與文獻(xiàn)0.2%乙酸水提取和SPE凈化以及超濾等方法相比，該方法改進(jìn)了基質(zhì)效應(yīng)問(wèn)題，具有結(jié)果可靠、靈敏高、重現(xiàn)性好；操作簡(jiǎn)單、低成本、省時(shí)高效的優(yōu)點(diǎn)，滿足目前河鲀魚(yú)肝臟樣品中TTX含量快速檢測(cè)的技術(shù)要求。

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