反相高效液相色譜法測定三尖杉中三尖杉酯堿研究

江慧，胡奎，王凡 劉先福，李俊凱

（長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州434025）

三尖杉屬（Cephalotaxus）是裸子植物中的一個(gè)小屬，分布于東亞及中南半島北部，主產(chǎn)于中國，在長江以南各地均有分布，主要分布在云南、海南等地［1］。三尖杉酯堿是我國特產(chǎn)的三尖杉屬植物中分離的抗腫瘤生物堿之一［2］，主要用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、急性粒細(xì)胞性白血病及惡性淋巴瘤等，并有較好的治療效果［3－5］。其用藥劑量少，作用原理比較獨(dú)特，與常用的抗白血病藥物無交叉耐藥性，在我國已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。但是，由于過度開發(fā)利用及生存環(huán)境的惡化，造成我國的三尖杉植物幾近滅絕，現(xiàn)在該樹種已經(jīng)被列為國家野生植物保護(hù)品種，資源極其缺乏，而且落后的分離檢測技術(shù)也限制了三尖杉植物的合理使用［6－7］。

目前，國外有關(guān)三尖杉酯堿測定的報(bào)道很多，但應(yīng)用高效液相色譜法檢測的卻很少［8－10］。因此，建立高效液相色譜法為尋找新的三尖杉植物資源、開發(fā)新的三尖杉生物堿提純分離技術(shù)、發(fā)現(xiàn)新的有效或可以用作半合成的化合物對深入三尖杉生物堿的研究、提高有限資源的利用率都有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC－10Avp高效液相色譜儀及工作站（帶UV－Vis檢測器及Class－vp色譜工作站），0.22μm微孔過濾器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE－52（上海亞榮生化儀器廠）。

三尖杉酯堿標(biāo)準(zhǔn)品購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；三尖杉植物樣品產(chǎn)品由長江大學(xué)生命科學(xué)院提供；乙酸銨、氨水、酒石酸、三氯甲烷、乙酸乙酯、無水碳酸鈉均為分析純，甲醇為色譜純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

采用ODS－C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；以甲醇∶0.02mol·L－1乙酸銨溶液（體積比48∶52）為流動相，流速1.0ml·min－1，柱溫40℃，檢測波長296nm，進(jìn)樣量20μl。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

精密稱取10.00mg三尖杉酯堿標(biāo)準(zhǔn)品于50ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容得0.2mg·ml－1母液。精密量取適量母液，分別用甲醇稀釋成含三尖杉酯堿10.0、5.0、2.5、1.0、0.5mg·L－1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣品的前處理

稱取三尖杉植物樣品20.00g，浸泡于80ml甲醇中，水浴回流24h，浸提3次，將浸提液減壓蒸干回收甲醇后，用40ml酒石酸（3%）水溶液溶解浸膏，溶液用30ml乙酸乙酯萃取3次，水層用飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH至8左右，然后用30ml氯仿萃取3次，將氯仿萃取液蒸干，用甲醇溶解，定容至2ml，待測［11］。

1.2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度測定

設(shè)置0.5、1.0、5.0mg·L－13個(gè)添加濃度，每個(gè)濃度重復(fù)3次，再按前述樣品處理方法處理后測定添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 三尖杉酯堿高效液相色譜分析的色譜圖

將三尖杉酯堿標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在前述色譜條件下進(jìn)行測定，以峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y＝3762.7 X－354.96（r＝0.9998），保留時(shí)間為29.337min。表明在該色譜條件下，樣品峰與雜質(zhì)峰能較好地分離（圖1），可見該方法具有良好的線性相關(guān)性。

圖1 三尖杉酯堿標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

按前述色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算其平均回收率在88.1～95.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3.6%。（表1）。

表1 添加回收率測定結(jié)果

2.3 實(shí)樣檢測

三尖杉植物樣品按前述方法對其進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，植物樣品被檢測出含有三尖杉酯堿，其濃度為4.3mg·L－1，植物樣品色譜圖如圖2所示。該檢測結(jié)果表明，該方法可以滿足對植物樣品中的三尖杉酯堿測定的要求。

圖2 植物樣品色譜圖

3 小結(jié)

三尖杉酯堿為三尖杉屬植物中的一種生物堿，微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。在反相高效液相色譜分析時(shí)，流動相中加入少量乙酸銨，有利于改善峰型，防止色譜峰拖尾現(xiàn)象。

本研究建立了反相高效液相色譜－紫外法（HPLC－UV）測定三尖杉植物樣品中三尖杉酯堿的方法。在該方法下，樣品的回收率穩(wěn)定，精密度及準(zhǔn)確度較好，適用于對三尖杉中三尖杉酯堿的測定。

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［11］朱云霞，侯衛(wèi)，李明.福建三尖杉中生物堿的高效液相分離與鑒定 ［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，43（6）：11－24.