高效液相色譜法測定瓜蔞薤白滴丸中乙酸乙酯部位槲皮素的含量及特征圖譜

鄢海燕，金 涌

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230032;2.皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

瓜蔞薤白滴丸是將瓜蔞薤白白酒湯經(jīng)劑型改造而制得。冠心病、心絞痛等屬于祖國醫(yī)學(xué)胸痹的范疇，出自《金匱要略》的瓜蔞薤白白酒湯具有通陽散結(jié)，行氣祛痰之功效，主治胸痹，是治療胸陽不振，氣滯痰阻所致胸痹證的常用方［1］。在瓜蔞薤白組方中檢測到了黃酮類化合物，如槲皮素［2－3］。采用高效液相色譜法測定瓜蔞薤白滴丸乙酸乙酯部位槲皮素的含量，同時以槲皮素為參照峰建立乙酸乙酯部位的特征圖譜，可為瓜蔞薤白滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-20A高效液相色譜儀(含LC-20A真空在線脫氣機(jī)、LC-20AT四元泵、CTO-10AS柱溫箱、SPD-M20A檢測器)，槲皮素對照品(中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，純度≥98%，批號:1206-08219)，甲醇、乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。13批瓜蔞薤白滴丸(自制，原料來源為藥店和亳州藥材市場)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備［4－5］

2.1.1 對照品溶液 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12 h的槲皮素對照品適量，加15%甲醇制得含槲皮素約100 mg/L的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取瓜蔞薤白滴丸適量(約相當(dāng)于瓜蔞薤白2 g)，用適量水溶解后，置于分液漏斗中，加入等量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯，殘渣用10 ml乙腈溶解，得乙酸乙酯部位供試品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.2 色譜條件［4］色譜柱為 Lichrospher C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，以乙腈-1%H3PO4溶液為流動相，梯度洗脫(1%H3PO4:0～5 min，80%→75%;5～10 min 75% →73%;10～13 min，73% →72%;13～15 min，72%→72%;15～20 min，72% →70%;20～25 min，70%→69%;25 ～30 min，69%→67%;30～35 min，67%→60%;35 ～40 min，60%→55%;40 ～50 min，55%→55%)，流速:1.0 ml/min;柱溫30℃;檢測波長為360 nm。計算程序:采用MATLAB語言自編程序及梁逸曾教授編制的《計算機(jī)輔助相似性評價系統(tǒng)》。

2.3 槲皮素色譜峰的確認(rèn) 瓜蔞薤白滴丸乙酸乙酯提取物、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，見圖1～2。經(jīng)采用標(biāo)準(zhǔn)品加入法及漸進(jìn)窗口正交投影分析法對色譜峰匹配［4，6］，見圖 3，樣品中 14 號峰為槲皮素。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 ml于 10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度。按2.2項方法取各對照品溶液10 μl進(jìn)樣，以槲皮素進(jìn)樣的質(zhì)量(μg)作為橫坐標(biāo)X，峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并回歸處理，結(jié)果表明，槲皮素在0.10～2.00 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；貧w方程為:y=9 812.2x+2 433.5，相關(guān)系數(shù) r=0.999 8。

2.4.2 精密度試驗 取對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次(每次 10 μl)，槲皮素峰面積積分值的 RSD為0.67%。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批樣品5份，精密稱定，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定，槲皮素峰面積積分值的RSD為1.90%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密量取同一供試品溶液，在24 h 內(nèi)按 0、6、12、18、24 h 間隔進(jìn)樣 5 次，供試品中槲皮素峰面積積分值的RSD為1.97%。

圖1 瓜蔞薤白滴丸乙酸乙酯部位HPLC特征圖譜Fig 1 HPLC characteristic spectrum of ethyl acetate extraction in Gualou Xiebai pills

圖2 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜Fig 2 HPLC spectrum of quercetin standard reference

圖3 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品與瓜蔞薤白滴丸乙酸乙酯部位特征圖譜正交投影前后光譜矢量夾角余弦圖Fig 3 Chart of vector angle's cosine before and after orthogonal projection on characteristic spectrum between quercetin standard reference and ethyl acetate extraction in Gualou Xiebai pills

2.4.5 回收率試驗 精密稱取2.0 g已知槲皮素含量的樣品6份，分別加入槲皮素對照品適量，按2.2方法操作，依法測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

2.5 樣品含量測定 按2.2方法，測定13批瓜蔞薤白滴丸樣品，結(jié)果見表2。

2.6 瓜蔞薤白滴丸乙酸乙酯部位HPLC特征圖譜構(gòu)建

2.6.1 特征圖譜的測定 根據(jù)13批次供試品測定結(jié)果，瓜蔞薤白滴丸乙酸乙酯部位高效液相色譜可分離出50多個色譜峰，經(jīng)譜峰識別窗口(峰面積/所有峰面積的加和≥0.005)篩選，得到共有峰圖譜，如圖1。13批樣品的特征圖譜見圖4。

表1 瓜蔞薤白滴丸樣品中槲皮素的加樣回收率試驗結(jié)果Tab 1 The average recovery rate of the quercetin in Gualou Xiebai pills

表2 樣品測定結(jié)果Tab 2 Testing results of the samples

圖4 13批樣品的特征圖譜Fig 4 Characteristic spectrum for the samples of 13 batches

圖5 共有模式圖譜Fig 5 Spectrum of the common pattern

2.6.2 共有峰的指定 上述指紋圖譜中，以槲皮素峰為參比峰，將其保留時間設(shè)置為1.00，標(biāo)定的共有峰(相對保留時間)順序如下:1(0.11)，2(0.31)，3(0.33)，4(0.36)，5(0.38)，6(0.44)，7(0.52)，8(0.54)，9(0.58)，10(0.60)，11(0.81)，12(0.87)，13(0.97)，14(1.00)，15(1.02)，16(1.12)，17(1.35)，18(1.37)，19(1.41)，20(1.43)，21(1.54)，22(1.60)。

2.6.3 指紋圖譜相似度的計算 分別以13批樣品指紋圖譜共有峰峰面積的均值和中位數(shù)建立對照模板，如圖5。利用相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法計算指紋圖譜的相似度，2種方法計算的相似度結(jié)果見表3。

表3 相似度計算結(jié)果Tab 3 Results of similarity calculation

3 討論

有關(guān)文獻(xiàn)對于瓜蔞仁的定量一般采用以其中的3，29-二苯甲?；闃侨嗜紴橹笜?biāo)［7，9］，但由于該標(biāo)準(zhǔn)品的價格較貴且其單體非常不穩(wěn)定，而槲皮素又為瓜蔞薤白乙酸乙酯提取物中的藥效成分［2－3］，因此本實驗采用以槲皮素為定量指標(biāo)，建立了含量測定方法。槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品易得，成分穩(wěn)定，方法精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好，可作為瓜蔞薤白滴丸質(zhì)量控制方法之一。

中藥指紋圖譜作為天然藥物的質(zhì)量控制方法目前在國內(nèi)外已被廣泛接受［10］。美國藥典、英國藥典、印度藥典及WHO草藥評價指南均收載了指紋圖譜［11］。在已有研究基礎(chǔ)的中藥注射劑、口服固體制劑和提取物等的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，《中國藥典》2010版首次采用指紋圖譜或特征圖譜技術(shù)控制產(chǎn)品質(zhì)量，體現(xiàn)了中藥多靶點作用的特性。為此，我們建立了瓜蔞薤白滴丸乙酸乙酯部位HPLC特征圖譜，取共有峰的均值和中位數(shù)，利用相關(guān)系數(shù)法計算平均相似度，分別為0.888 4和0.873 9;利用夾角余弦法計算相度，分別為0.921 7和0.913 1。利用該特征圖譜可從整體性上控制瓜蔞薤白滴丸的質(zhì)量。

本實驗對13批瓜蔞薤白滴丸中的槲皮素成分進(jìn)行了含量測定，平均值為0.014%，RSD為10.2%。從圖4也可以直觀地看出，13批樣品的色譜峰的峰面積或峰高不完全一致，反映出不同產(chǎn)地的瓜蔞、薤白原料對產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量有一定的影響。因此，應(yīng)按照GAP要求規(guī)范管理瓜蔞、薤白藥材種植以確保瓜蔞薤白滴丸質(zhì)量的一致性。

［1］李明明，黃芳，韓林濤，等.瓜蔞薤白白酒湯對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(16):182－186.

［2］何祥久，王乃利，邱峰，等.瓜蔞薤白白酒湯活性成分研究(Ⅲ):黃酮類活性成分［J］.中國中藥雜志，2003，28(5):420 －423.

［3］鄢海燕，鄒純才.瓜蔞薤白顆粒中總黃酮的含量測定［J］.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，31(6):444 －446.

［4］鄢海燕，鄒純才.瓜蔞薤白顆粒的高效液相色譜特征圖譜及與組方藥味的研究［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33(4):276－280.

［5］鄢海燕，鄒純才，朱磊，等.瓜蔞薤白正丁醇部位腺苷含量及特征圖譜［J］.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，32(2):101 －103.

［6］鄒純才，鄢海燕，方洪壯.漸進(jìn)窗口正交投影分析法用于決明子色譜指紋圖譜峰的匹配［J］.中國中藥雜志，2009，34(22):2876－2879.

［7］國家藥典委員會.中國藥典(2010年版一部).北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:104.

［8］程雪梅，吳弢，侴桂新，等.RP-HPLC法測定瓜蔞子中3，29-二苯甲?；闃侨嗜己浚跩］.藥物分析雜志，2005，25(4):377－380.

［9］楊曉穎.氣相色譜法 (GC)測定瓜蔞子中3，29-二苯甲?；闃侨嗜嫉暮浚跩］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012，28(24):26 －27.

［10］鄒純才，鄢海燕.中藥指紋圖譜及其數(shù)字化［M］.合肥:安徽科學(xué)技術(shù)出版社，2008:15.

［11］杭太俊.藥物分析［M］.7版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:520.