海馬齒根際降解可溶性蛋白質(zhì)的研究

楊 芳，李 凱，黃凌風(fēng)，3＊，朱小明

（1.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門361102；2.廈門大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳518057；3.濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廈門大學(xué)），4.廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建 廈門361102）

植物修復(fù)（phytoremediation）是指利用植物及其根際微生物的代謝活動來吸收、積累或降解轉(zhuǎn)化環(huán)境中的污染物以達(dá)到凈化、修復(fù)環(huán)境的目的.植物修復(fù)方式包括植物萃取、根際過濾、植物固定、植物揮發(fā)、植物降解和根際降解.其中，根際降解又稱為植物－微生物協(xié)同修復(fù)，是指綠色植物及其共存微生物體系，通過促進(jìn)植物的根系和根系周圍微生物的活性和生化反應(yīng)，使污染物釋放、吸收和轉(zhuǎn)化而降低或去除其毒性，達(dá)到凈化環(huán)境的一種污染治理技術(shù).

植物根際環(huán)境存在著胞外酶（extracellular enzymes），胞外酶可能由植物根系釋放，也可能由根際微生物分泌.在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，只有小部分的溶解有機(jī)物（DOM）可以直接通過細(xì)胞膜被異養(yǎng)微生物所利用，但這遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足微生物的營養(yǎng)需求.約80%～90%的DOM以高聚物（如蛋白質(zhì)等）的形式存在，但無法被直接吸收利用，只有通過胞外酶的解聚作用才能使它們轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿佑袡C(jī)物，從而被異養(yǎng)微生物吸收［1－3］.大部分已知的亮氨酸氨基肽酶能以胞外酶的形式出現(xiàn)，并能通過水解那些不能直接穿透進(jìn)入有機(jī)體的多肽和蛋白質(zhì)，釋放出游離的氨基酸，從而供細(xì)菌利用.已有的研究表明，胞外酶的分解作用是有機(jī)質(zhì)降解的關(guān)鍵因素，胞外酶活性的大小能從一定程度上反映有機(jī)物的降解速率.胞外酶在有機(jī)質(zhì)的礦化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，控制著生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)，在一定程度上決定著生態(tài)系統(tǒng)的凈化功能［4］.胞外酶活性還可以作為反映水體富營養(yǎng)化程度的指標(biāo)［5］.因此，胞外酶的研究對于全面理解生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、評估水域環(huán)境質(zhì)量和探討生態(tài)修復(fù)機(jī)制等都具有重要意義.

海馬齒（Sesuvium portulacastrumLinn.）又名濱水菜，為番杏科（Aizonaceae）海馬齒屬（Sesuvium）植物，是生長在海邊沙地或鹽堿地的多年生匍匐性肉質(zhì)草本植物，在我國主要分布于福建、廣東、海南、臺灣及澎湖列島的海岸［6］，浮床種植海馬齒可在海水環(huán)境中正常生長.海洋灘涂耐鹽植物海馬齒作為一種應(yīng)用于海水生態(tài)浮床技術(shù)的重要修復(fù)植物，其對富營養(yǎng)化水體的氮、磷營養(yǎng)鹽和有機(jī)質(zhì)的去除能力已得到了一定的認(rèn)識和肯定［7］，但關(guān)于其修復(fù)機(jī)制，尤其是根圈系統(tǒng)對海水環(huán)境中蛋白質(zhì)等有機(jī)質(zhì)降解的相關(guān)酶學(xué)機(jī)制的研究報(bào)道還很少.牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是常用的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，在可溶性蛋白質(zhì)含量的測定等蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用［8－10］.本文報(bào)道了水培海馬齒對以BSA為代表的可溶性蛋白質(zhì)的根際降解作用及其與根際微生物胞外水解酶活性有關(guān)的影響因素，旨在探討海馬齒根系及其根際微生物在蛋白質(zhì)等有機(jī)質(zhì)降解中所發(fā)揮的重要作用，為更好地利用海馬齒生態(tài)浮床修復(fù)海水環(huán)境中的有機(jī)氮提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)用海馬齒植株為本實(shí)驗(yàn)室從西沙群島引種并在溫室中通過水培方法建立的植株，培養(yǎng)用水為廈門西海域海水.單株平均鮮質(zhì)量為（15.0±0.5）g，根系發(fā)育良好.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

取同一批預(yù)培養(yǎng)的海馬齒植株，剔除枯黃葉片并清洗后稱量，選擇長勢均勻、鮮質(zhì)量為每株（15.0±0.5）g的植株，在經(jīng)0.22μm濾膜過濾并滅菌的海水中暫養(yǎng)7d，以獲得含根際微生物的預(yù)培養(yǎng)水.

設(shè)置了抑菌和不抑菌2組實(shí)驗(yàn)，每組又分為種植海馬齒的植物組、不種植海馬齒的細(xì)菌組和空白對照組.每組分別設(shè)置3個平行樣.

抑菌實(shí)驗(yàn)根據(jù) Weinberger［11］的方法采用3種抗生素，分別是氨芐霉素（ampicillin）、頭孢噻肟（cefotaxime）和萬古霉素（vancomcin），添加質(zhì)量濃度均為100mg／L.這3種抗生素既可以同時抑制G＋和G－菌形成細(xì)胞壁，又不會對植物的生理活動產(chǎn)生影響［12］.預(yù)實(shí)驗(yàn)表明該抗生素濃度能抑制水中微生物的繁殖，但不影響植物的正常生長.不抑菌實(shí)驗(yàn)不添加抗生素.

每個樣品的培養(yǎng)液初始體積是500mL.植物組和細(xì)菌組的培養(yǎng)用水是400mL經(jīng)0.22μm濾膜過濾的滅菌海水和100mL根際預(yù)培養(yǎng)水混合而成.對照組的培養(yǎng)用水是400mL經(jīng)0.22μm濾膜過濾的滅菌海水和100mL經(jīng)0.22μm濾膜過濾并滅菌的根際預(yù)培養(yǎng)水混合而成.每組加入營養(yǎng)鹽以滿足植物生長的需要，各種營養(yǎng)鹽按照Hoagland配方添加.

不抑菌實(shí)驗(yàn)中，對照組用于反映非生物因素在蛋白質(zhì)降解中的作用，細(xì)菌組用于反映根際細(xì)菌和非生物因素在蛋白質(zhì)降解中的作用，植物組用于反映植物、根際細(xì)菌和非生物因素在蛋白質(zhì)降解中的作用.抑菌實(shí)驗(yàn)中的植物組用于反映植物根系和非生物因素在蛋白質(zhì)降解中的作用.利用差減法計(jì)算的結(jié)果可以分別顯示植物與根際細(xì)菌聯(lián)合作用、植物根系以及根際細(xì)菌對蛋白質(zhì)根際降解的貢獻(xiàn)率.

實(shí)驗(yàn)裝置由柱狀玻璃容器（Ф：5.0cm，L：30 cm）、日光燈光源和取樣管組成.柱狀玻璃容器外表面和瓶口緊密包裹鋁箔，以防止外源微生物污染、蛋白質(zhì)的光解和藻類的生長.日光燈置于柱狀玻璃容器上方約50cm 處，在室溫（28±2）℃，12h光照（6 000lx）和12h黑暗交替條件下培養(yǎng).為了減少取樣時根際水體的擾動，用一次性無菌注射管作為取樣管，放置于柱狀玻璃瓶中，外用橡皮筋固定，并用止水夾保持培養(yǎng)體系密閉以防止外源微生物污染和工作液中溶解氧的改變.

每隔12h取樣一次，每次取樣時用一次性注射管吸取10mL水樣用于BSA濃度、細(xì)菌密度和亮氨酸氨基肽酶活性的測定.分別在36和72h取樣后，再次添加BSA（質(zhì)量濃度為10mg／L）、Hoagland營養(yǎng)鹽和3種抗生素（質(zhì)量濃度均為100mg／L，僅在抑菌實(shí)驗(yàn)組中添加）.

1.3 主要分析指標(biāo)和方法

1.3.1 BSA含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法.取125mg考馬斯亮藍(lán)G－250充分溶解在100mL 95%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇中，另取15mL 37%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的 HCl和5.06g NaCl溶解在適量水中后，與考馬斯亮藍(lán)乙醇液混合并定容至1 000mL，用0.45μm 濾膜過濾，即為顯色液.測定時，取5mL顯色液與1mL水樣混合，放置5min后用Spectum 756PC型紫外可見分光光度計(jì)在波長595nm下測定吸光值.

同時，配制質(zhì)量濃度為0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20μg／mL的BSA溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.2 亮氨酸氨基肽酶活性的測定

采用熒光模擬底物法（fluorogenic model substrate，F(xiàn)MS）［13］.如圖1所示，熒光模擬底物包含一個熒光生色團(tuán)和一個小分子，熒光生色團(tuán)采用4－甲基－7－氨基香豆素（MCA），小分子為氨基酸，兩者之間通過肽鍵相連.在氨基肽酶的作用下，復(fù)合分子發(fā)生斷裂，熒光基團(tuán)顯色.胞外酶的活性越高，復(fù)合分子斷裂的越多、越快，因此熒光強(qiáng)度越高.這種模擬底物的胞外酶水解作用符合米氏方程，檢測限低，適合短時間條件下的胞外酶測定.該方法以其高度的靈敏度已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種水體的胞外酶活性測定中［14－17］.

圖1 熒光模擬底物水解方程式Fig.1 Reaction equator of model substrate

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制100μmol／L MCA的乙二醇單甲醚溶液，再用過濾滅菌海水稀釋成0.000 5，0.001，0.002 5，0.005，0.007 5，0.01，0.025，0.05，0.075，0.1，0.25，0.5，0.75，1μmol／L 14個濃度的溶液.用島津RF5301PC熒光分光光度計(jì)迅速測定各溶液的熒光強(qiáng)度.MCA激發(fā)光和發(fā)射光的波長分別為380和440nm.狹縫寬Ex＝3nm，Em＝3nm.

酶活性的測定方法如下：移取3mL水樣到5個5 mL的凍存管中（2個空白樣和3個平行樣），立即往平行樣中加入0.5mmol／L熒光模擬底物工作液120 μL，使其終濃度為20μmol／L；同時在空白樣中加入80μL濃度為100mmol／L的HgCl2溶液使胞外酶失活，在20℃下避光培養(yǎng)2h.培養(yǎng)結(jié)束后在空白樣中加入等量的熒光模擬底物工作液，并用HgCl2溶液終止平行樣中的反應(yīng).用島津RF5301PC熒光分光光度計(jì)迅速測定樣品的熒光強(qiáng)度.按下式計(jì)算水樣中的胞外酶活性：

式中，V 為胞外酶水解底物的速率（μmol／（L·h））；F為平行樣品的熒光強(qiáng)度（平均值，μmol／L）；Fb為空白樣品的熒光強(qiáng)度（平均值，μmol／L）；S為單位濃度標(biāo)準(zhǔn)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度（S＝79.807），即標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率；t為培養(yǎng)時間（h）.

1.3.3 細(xì)菌密度測定

采用DAPI染色的熒光顯微計(jì)數(shù)法［18］，測定前將孔徑為0.22μm的硝酸纖維濾膜用蘇丹黑B染液（500mg Sudan Black B溶于200mL 2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乙酸中）染色4h以上，使之變黑.取1mL水樣加入2 mL滅菌離心管中，加入40μL 25%（體積分?jǐn)?shù)）戊二醛溶液固定，再加入20μL DAPI染液（質(zhì)量濃度為20 μg／mL），避光染色5min后，在小于7 093Pa負(fù)壓下過濾，濾干后取濾膜制片，用Leica DM 4500B型熒光顯微鏡進(jìn)行熒光顯微計(jì)數(shù).按下式計(jì)算水樣中的細(xì)菌密度

式中，D為細(xì)菌密度（mL－1）；A 為10個視野的細(xì)菌平均數(shù)（cell）；S1為視野面積（cm2）；S2為濾膜的有效過濾面積（cm2）；V 為過濾水樣體積（mL）.

1.4 數(shù)據(jù)分析

測量數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)用Origin 8.1和SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，處理組間差異的顯著性采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 BSA的降解

不抑菌實(shí)驗(yàn)中，每次添加蛋白質(zhì)后，植物組的蛋白質(zhì)濃度下降最快（圖2）.細(xì)菌組的變化趨勢與對照組相似，并且其水體中蛋白質(zhì)濃度都是隨著添加次數(shù)的增多而逐漸積累升高.36h后，植物組、細(xì)菌組和對照組蛋白的平均降解率分別是97%、41%和26%，細(xì)菌組的蛋白降解率低于植物組.利用差減法扣除非生物因素作用（26%），海馬齒與根際微生物聯(lián)合作用下的降解率（71%）是根際微生物作用（15%）的4.73倍.表明單獨(dú)的根際微生物可以降解蛋白質(zhì)，但是其降解率不高，要實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高效降解必須以海馬齒根系為依托.

在抑菌實(shí)驗(yàn)中，植物組、細(xì)菌組和對照組的變化趨勢一致，都是隨著添加次數(shù)的增多，蛋白質(zhì)濃度逐漸升高（圖3）.植物組并沒有表現(xiàn)出明顯高于其他組的降解效率.表明單獨(dú)的海馬齒根系無法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高效降解.蛋白質(zhì)的濃度在每次添加后期有所升高，呈現(xiàn)“V”型的變化特點(diǎn)，推測原因可能是部分吸附在瓶壁上的蛋白質(zhì)由于室溫變化等原因發(fā)生了解吸，導(dǎo)致后期濃度有所上升.

以上結(jié)果說明，單獨(dú)的根際微生物或海馬齒根系都無法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高效降解.海馬齒根系與根際微生物聯(lián)合在蛋白質(zhì)的根際降解中發(fā)揮著極為重要的作用.

2.2 BSA降解過程中細(xì)菌密度的變化

圖2 不抑菌實(shí)驗(yàn)中BSA質(zhì)量濃度隨時間的變化Fig.2 Changes of BSA concentration in the experiment groups without antibiotic addition

圖3 抑菌實(shí)驗(yàn)中BSA質(zhì)量濃度隨時間的變化Fig.3 Changes of BSA concentration in the experiment groups with antibiotic addition

在不抑菌實(shí)驗(yàn)中，在0到36h內(nèi)，植物組蛋白質(zhì)的高效降解為細(xì)菌生長提供營養(yǎng)，其細(xì)菌密度的增長速度明顯快于細(xì)菌組.植物組和細(xì)菌組的細(xì)菌密度基本都是呈現(xiàn)初期快速增長、中期下降和后期基本穩(wěn)定的單峰型變化趨勢（圖4）.而整個實(shí)驗(yàn)過程中，對照組沒有檢測到細(xì)菌的存在，可以有效反映非生物因素的作用.

在抑菌實(shí)驗(yàn)中，對照組沒有檢測到細(xì)菌的存在.植物組和細(xì)菌組的細(xì)菌密度基本都呈下降趨勢（圖5），細(xì)菌密度分別從開始時的3.0×105和2.8×105mL－1逐漸下降到結(jié)束時的0.7×105和0.5×105mL－1，其數(shù)量與不抑菌實(shí)驗(yàn)相比，可以忽略不計(jì).表明實(shí)驗(yàn)所采用的抗生素可以有效抑制細(xì)菌數(shù)量的增長，抑菌實(shí)驗(yàn)中的植物組可以較好地反映單純海馬齒根系在蛋白質(zhì)降解中的作用.

2.3 BSA降解過程中亮氨酸氨基肽酶活性的變化

圖4 不抑菌實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌密度隨時間的變化Fig.4 Changes of bacterial density in the experiment groups without antibiotic addition

圖5 抑菌實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌密度隨時間的變化Fig.5 Changes of bacterial density in the experiment groups with antibiotic addition

在抑菌實(shí)驗(yàn)中，雖然細(xì)菌組和植物組的細(xì)菌密度在0～12h時可達(dá)105mL－1，但是對照組、細(xì)菌組和植物組都沒有檢測到亮氨酸氨基肽酶活性，表明抑菌實(shí)驗(yàn)的抗生素抑菌效果良好，細(xì)菌活性受到了全面抑制，而單純的海馬齒根系不分泌亮氨酸氨基肽酶.由此可以推斷，在不抑菌實(shí)驗(yàn)中檢測到較高活性的亮氨酸氨基肽酶完全是由根際微生物所分泌.

不抑菌實(shí)驗(yàn)中，對照組沒有檢測到亮氨酸氨基肽酶活性，只有植物組和細(xì)菌組有明顯的酶活（圖6）.這2組的酶活性變化趨勢較為相似，而植物組的酶活性始終高于細(xì)菌組.實(shí)驗(yàn)開始的24h內(nèi)，植物組的酶活性急劇上升，24h時達(dá)到最高值0.75μmol／（L·h），此后酶活性呈下降趨勢，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，酶活性下降到0.22μmol／（L·h）.細(xì)菌組的酶活性最高值出現(xiàn)在60 h，達(dá)到0.43μmol／（L·h），在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，酶活性檢測不到.從整體上看，植物組和細(xì)菌組的酶活性也是基本呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢.

圖6 不抑菌實(shí)驗(yàn)中亮氨酸氨基肽酶活性隨時間的變化Fig.6 Changes of leucine amino peptidase activity in the experiment groups without antibiotic addition

與細(xì)菌組相反，植物組的酶活性最高值出現(xiàn)時間（24h）早于細(xì)菌密度最高值（36h）.說明在海馬齒根系和根際微生物聯(lián)合作用下，植物組蛋白質(zhì)的高效降解過程伴隨著酶活性的升高和細(xì)菌密度的增加，且酶活性的升高先于細(xì)菌數(shù)量的增長.

3 討 論

抑菌實(shí)驗(yàn)中的植物組沒有檢測出亮氨酸氨基肽酶活性，表明該蛋白酶完全由根際微生物分泌，海馬齒根系不分泌該種胞外酶.大部分水環(huán)境中的研究表明亮氨酸氨基肽酶活性主要是由異養(yǎng)細(xì)菌產(chǎn)生的［19－21］.而也有研究者認(rèn)為蛋白酶可以由植物根系釋放，如Gramms等［22］研究發(fā)現(xiàn)，豆科、禾本科和茄科的一些植物種類能夠向根系區(qū)域大量釋放氧化酶和水解酶，這些酶包括蛋白酶、過氧化物酶、漆酶、單酚氧化酶、脂肪酶以及酯酶等.另有研究表明，亮氨酸氨基肽酶是植物體內(nèi)廣泛存在的一種金屬蛋白酶［23］，可以有效切割N端的亮氨酸、精氨酸和蛋氨酸殘基［24］，可能對蛋白半衰期具有重要的調(diào)節(jié)作用，關(guān)系細(xì)胞的生長和凋亡［25］.

從整體上看，不抑菌實(shí)驗(yàn)中的植物組和細(xì)菌組的酶活基本呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這一趨勢基本上符合目前比較流行的胞外酶活性調(diào)控機(jī)制——“抑制－誘導(dǎo)”假說［26－27］.該學(xué)說認(rèn)為當(dāng)海水中存在大量初級代謝產(chǎn)物以及光合作用產(chǎn)物時，這些易于被吸收利用的低分子質(zhì)量產(chǎn)物（UDOM）容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以維持細(xì)菌的正常生長及新陳代謝.同時這些UDOM（如氨基酸、單糖和有機(jī)酸等）限制了胞外酶的活性（產(chǎn)物抑制）并且抑制了酶的合成（代謝抑制）.而當(dāng)海水中的UDOM降低到臨界值，藻類細(xì)胞通過裂解釋放出大量的高分子化合物（如蛋白質(zhì)、多糖、酯類或核酸等）時，胞外酶的抑制被解除，酶活性顯著升高.

在不抑菌實(shí)驗(yàn)中，植物組的酶活性最高值和細(xì)菌密度最大值的出現(xiàn)時間均早于細(xì)菌組，并且植物組的酶活始終高于細(xì)菌組.表明海馬齒根系可以促進(jìn)根際細(xì)菌的生長和亮氨酸氨基肽酶活性的升高.也有其他研究證實(shí)植物根系可以增強(qiáng)根際胞外酶活性［28－30］，如棉花、小麥、水芹、西紅柿和水葫蘆等植物能向根際環(huán)境中提供氨基酸、糖類和維生素等養(yǎng)料，改善根際微生態(tài)環(huán)境，間接促進(jìn)胞外酶活性的升高.

由于亮氨酸氨基肽酶完全由根際細(xì)菌分泌，根際細(xì)菌在蛋白質(zhì)的根際降解過程中起著主要的作用，但是不抑菌實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌組的降解率不高且明顯低于植物組，說明根際細(xì)菌的高效降解必須以海馬齒根系為依托.海馬齒根系和根際細(xì)菌的協(xié)同作用使得蛋白質(zhì)的降解效率明顯提高，其原因一方面可能是植物可以通過根系將氧氣釋放進(jìn)入水體，保證微生物有充足的氧氣對蛋白質(zhì)進(jìn)行降解.另一方面是根系分泌物可以改變根系周圍環(huán)境的pH值［31］、可能為微生物提供共代謝的底物［32－33］.許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，向土壤中添加根系分泌物同樣能刺激微生物的活性.Abdel－Nasser［34］證實(shí)向土壤中添加人工合成的大麥根系分泌物可以刺激土壤中放線菌、真菌和細(xì)菌的數(shù)量.向土壤中添加燕麥的根系分泌物可以促進(jìn)菲的降解［35］，而向土壤中添加玉米的根系分泌物可以顯著提高14C－芘的礦化率［36］.由此可以看出根系分泌物在有機(jī)物根際降解中的重要作用.

4 結(jié) 論

1）本研究的不抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明海馬齒的根際微生物具有降解蛋白質(zhì)的能力，其降解效率在有植物根系存在時明顯高于無根系時的降解效率，說明植物根系對于根際微生物降解蛋白質(zhì)有重要促進(jìn)作用.

2）抑菌實(shí)驗(yàn)表明氨芐霉素－頭孢噻肟－萬古霉素的抗生素組合能有效抑制海馬齒根際微生物的生長.在有效抑菌的情況下，整個實(shí)驗(yàn)過程中，植物組與細(xì)菌組都未檢測到亮氨酸氨基肽酶的活性，說明能高效降解可溶性蛋白質(zhì)的亮氨酸氨基肽酶完全來源于根際微生物，而非由海馬齒根系所分泌.

3）以上表明，在可溶性蛋白質(zhì)的根際降解中，根際細(xì)菌是降解的執(zhí)行者，但是根際細(xì)菌的高效降解是以植物根系為依托的，植物根系和根際細(xì)菌構(gòu)成互惠共生的關(guān)系.這為更好利用海馬齒生態(tài)浮床修復(fù)富含有機(jī)氮的海水環(huán)境提供了理論依據(jù).

［1］鄭天凌，王斐，徐美珠，等.臺灣海峽水域的β－葡萄糖苷酶活性 ［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2001，7（2）：175－182.

［2］Hoppe H.Use of fluorogenic model substrates for extracellular enzyme activity（EEA）measurement of bacteria［M］∥ Handbook of methods in aquatic microbial ecology.Boca Raton：Lewis Publishers，1993：423－431.

［3］王斐，鄭天凌，洪華生.細(xì)菌胞外酶的生態(tài)作用 ［J］.海洋科學(xué)，1999，3（3）：33－36.

［4］Sinsabaugh R，Antibus R，Linkins A，et al.Wood decomposition：nitrogen and phosphorus dynamics in relation to extracellular enzyme activity ［J］.Ecology，1993，74（5）：1586－1593.

［5］Wright R R，Hobbie J E.Use of glucose and acetate by bacteria and algae in aquatic ecosystem ［J］.Ecology，1966，47：447－464.

［6］唐昌林.中國植物志［M］.北京：科學(xué)出版社，1996：30－32.

［7］張志英，黃凌風(fēng)，姜丹，等.浮床種植海馬齒對富營養(yǎng)化海水氮、磷移除能力的初步研究 ［C］∥中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會2009年學(xué)術(shù)年會論文集.北京：北京航空航天大學(xué)出版社，2009：50－55.

［8］陸建良，梁月榮，張凌云.考馬斯亮藍(lán)法在茶湯可溶性蛋白含量分析中的應(yīng)用和改良 ［J］.茶葉，2002，28（2）：89－93.

［9］曲春香，沈頌東，王雪峰，等.用考馬斯亮藍(lán)測定植物粗提液中可溶性蛋白質(zhì)含量方法的研究 ［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，22（2）：82－85.

［10］袁燕，段玲燕，郭麗紅，等.BCA法測定新的植物毒素——蒜頭果蛋白質(zhì)量濃度 ［J］.昆明學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31（3）：60－61.

［11］Weinberger F，Hoppe H，F(xiàn)riedlander M.Bacterial induction and inhibition of a fast mecrotic response in Gracilaria conferta （Rhodophyta）［J］.Journal of Applied Phycology，1997，9（3）：277－285.

［12］de Souza M，Chu D，Zhao M，et al.Rhizosphere bacteria enhance selenium accumulation and volatilization by Indian mustard ［J］.Plant Physiology，1999，119（2）：565－574.

［13］宋福行，焦念志.細(xì)菌胞外酶活性的調(diào)控因素 ［J］.海洋科學(xué)，2001，25（9）：16－18.

［14］Martinez J.Variability in ecohydroytic enzyme activities of pelagic marine bacteria and its significance for substrate processing in the sea［J］.Aquatic Microbial Ecology，1996，10（4）：223－230.

［15］Hoppe H.Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water：measurements by means of methylumbelliferyl－substrates［J］.Marine Ecology Pro－gress Series，1983，11（1）：299－308.

［16］Ecology A.Coupling between bacterioplankton species composition，population dynamics，and organic matter degradation［J］.Aquatic Microbial Ecology，1999，17（1）：13－26.

［17］Hoppe H，Kim S，Gocke K.Microbial decomposition in aquatic environments：combined process of extracellular enzyme activity and substrate uptake［J］.Applied and Environmental Microbiology，1988，54（3）：784－790.

［18］鄭天凌，王斐，徐美珠，等.臺灣海峽海域細(xì)菌產(chǎn)量、生物量及其在微食物環(huán)中的作用［J］.海洋與湖沼，2002，33（4）：415－423

［19］Rosso A L，Azam F.Proteolytic activity in coastal oceanic waters：depth distribution and relationship to bacterial populations［J］.Marine Ecology Progress Series，1987，41：231－240.

［20］Jacobsen T R，Rai H.Determination of aminopeptidase activity in lakewater by a short term kinetic assay and its application in two lakes of differing eutrophication［J］.Archiv Fur Hydrobiologie，1988，113：359－370.

［21］Fabiano M，Danovaro R.Enzymatic activity，bacterial distribution，and organic matter composition in sediments of the Ross Sea （Antarctica）［J］.Applied and Environmental Microbiology，1998，64：3838－3848.

［22］Gramss G，Voigt K D，Kirsche B.Oxidoreductase enzymes liberated by plant roots and their effects on soil humic material ［J］.Chemosphere，1999，38 （7）：1481－1494.

［23］Bartling D，Weiler E W.Leucine aminopeptidase from Arabidopsis－thaliana－molecular evidence for a phylogenetically conserved enzyme of protein－turnover in higher－plants ［J］.European Journal of Biochemistry，1992，205（1）：425.

［24］Gu Y Q，Walling L L.Specificity of the wound－induced leucine aminopeptidase （LAP－A）of tomato－activity on dipeptide and tripeptide substrates［J］.European Journal of Biochemistry，2000，267（4）：1178.

［25］Varshavsky A.The N－end rule：functions，mysteries，uses［J］.Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93（22）：12142.

［26］Chróst R.Characterization and significance ofα－glucosidase activity in lake water［J］.Limnology and Oceanography，1989，34（4）：660－672.

［27］Chróst R.Microbial enzyme in aquatic environments［M］∥Aquatic microbial ecology，biochemical and molecular approaches.New York：Springer，1990：47－79.

［28］李傳榮，許景偉，宋海燕，等.黃河三角洲灘地不同造林模式的土壤酶活性 ［J］.植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，30（5）：802－809.

［29］Garcia C，Roldan A，Hernandez T.Ability of different plant species to promote microbiological processes in semiarid soil［J］.Geoderma，2005，124（1／2）：193－202.

［30］Siegel B.Plant peroxidases：an organismic perspective［J］.Plant Growth Regulation，1993，12（3）：303－312.

［31］Dakora F，Phillips D.Root exudates as mediators of mineral acquisition in low－nutrient environments［J］.Plant and Soil，2002，245（1）：35－47.

［32］Shann J.The role of plants and plant／microbial systems in the reduction of exposure［J］.Environmental Health Perspectives，1995，103（Sup.5）：13－15.

［33］Walton B，Anderson T.Microbial degradation of trichloroethylene in the rhizosphere：potential application to biological remediation of waste sites ［J］.Applied and Environmental Microbiology，1990，56（4）：1012－1016.

［34］Abdel－Nasser M，Moawad Hassan.Changes in numbers of microorganisms during decomposition of root exudates in soil［J］.Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr Hyg，1975，130（8）：738－744.

［35］Miya R，F(xiàn)irestone M.Enhanced phenanthrene biodegradation in soil by slender oat root exudates and root debris［J］.Journal of Environmental Quality，2001，30（6）：1911－1918.

［36］Yoshitomi K J，Shann J R.Corn（Zea mays L.）root exudates and their impact on14C－pyrene mineralization［J］.Soil Biology and Biochemistry，2001，33（12／13）：1769－1776.