復(fù)方萘甲唑啉滴眼液無(wú)菌檢查方法的驗(yàn)證

余曉霞 劉春霞 李磊

復(fù)方萘甲唑啉滴眼液為中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院配制的眼用制劑, 其主要成分為鹽酸萘甲唑啉、馬來(lái)酸氯苯那敏、硼酸和羥苯乙酯等, 具有減輕眼睛刺激感和結(jié)膜充血的作用,臨床適用于過(guò)敏性引起的眼睛炎癥?！吨袊?guó)藥典》2010年版［1］首次將無(wú)菌檢查納入眼用制劑檢查項(xiàng)下。因此, 需建立復(fù)方萘甲唑啉滴眼液無(wú)菌檢查方法并進(jìn)行驗(yàn)證。

1 儀器與材料

1.1 儀器 一次性全封閉無(wú)菌集菌過(guò)濾器(北京牛?；蚩萍加邢薰?、WJ-6無(wú)菌檢查儀(天津羅根科技)、303A-1生化培養(yǎng)箱(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)、SPX-100B生化培養(yǎng)箱(上海悅豐儀器儀表有限公司)。

1.2 試藥 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：140308), 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：140228), 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：130521),改良馬丁培養(yǎng)基(批號(hào)：1401222), 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：130910), 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(批號(hào)：1401152), 0.1%蛋白胨水溶液(批號(hào)：110221)。以上均來(lái)源于北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司。復(fù)方萘甲唑啉滴眼液(規(guī)格：10ml/瓶, 批號(hào)：201310228、201310238、201401178, 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 )。

1.3 菌種 大腸埃希菌(escherichia coli)［CMCC(B)44 102］,枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)［CMCC(B)63 501］, 金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)［CMCC(B)26 003］, 生孢梭菌(clostridum sporogens)［CMCC(B)64 941］, 白色念珠菌(candida albicans)［CMCC(F)98 001］, 黑曲霉(aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］, 銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa)［CMCC(B)10 104］(以上菌種的凍干菌均購(gòu)自中國(guó)食品藥品生物檢定研究院 )。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的肉湯培養(yǎng)物和生孢梭菌硫乙醇酸鹽液體新鮮培養(yǎng)物, 取經(jīng)23～28℃培養(yǎng)24～48 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物, 分別用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至每毫升含菌數(shù)<100 cfu的菌懸液。取經(jīng)23～28℃ 培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物, 加入3～5 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液, 將孢子洗脫。然后, 用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi), 用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每毫升含孢子數(shù)<100 cfu的孢子懸液。

2.2 最少檢驗(yàn)數(shù)量、檢驗(yàn)量的確定 供試品的裝量為10 ml,按《中國(guó)藥典》2010版二部附錄Ⅺ H無(wú)菌檢查法, 結(jié)果見(jiàn)表1,最少檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)為10個(gè)；按表2, 每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量為2 ml。

2.3 供試品管的制備 取供試品30支(批號(hào)：201310228、201310238、201401178)分2份, 15支/份, 用兩套一次性三聯(lián)管全封閉無(wú)菌集菌過(guò)濾器, 先用少量0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液濕潤(rùn)濾膜, 調(diào)節(jié)集菌儀轉(zhuǎn)速為160 r/min, 按薄膜過(guò)濾法全量過(guò)濾, 每膜用0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液300 ml分3次沖洗 , 在最后50 ml沖洗液中加入菌液1 ml［2］, 過(guò)濾至干 , 作為供試品管。

2.4 對(duì)照管的制備 取過(guò)濾器, 加入50 ml 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液, 加入相應(yīng)的菌液1 ml, 濾干, 作為對(duì)照管。

2.5 無(wú)菌檢查方法的驗(yàn)證 分別取含大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和生孢梭菌的供試品管, 各加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100 ml；含白色念珠菌和黑曲霉的供試品管, 各加入改良馬丁培養(yǎng)基100 ml, 置相應(yīng)培養(yǎng)溫度培養(yǎng)。取對(duì)照管6管, 其中4管分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基100 ml, 再分別加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和生孢梭菌菌液各1 ml；另2管分別加入改良馬丁培養(yǎng)基100 ml, 再分別加入白色念珠菌和黑曲霉菌液各1 ml,置相應(yīng)培養(yǎng)溫度培養(yǎng)。同時(shí), 取上述菌液各1 ml, 按微生物限度檢查法(平皿法)(中國(guó)藥典2010版二部附錄Ⅺ H)計(jì)數(shù),每個(gè)菌株平行制備2個(gè)平皿, 生孢梭菌用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基作液體計(jì)數(shù), 測(cè)定所加菌數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 驗(yàn)證結(jié)果

3 小結(jié)

由于復(fù)方萘甲唑啉滴眼液處方中含有羥苯乙酯和硼酸,均有抑菌作用, 因此實(shí)驗(yàn)初始沖洗量選擇了300 ml。由表1結(jié)果可見(jiàn), 與對(duì)照管比較, 供試品管中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好,說(shuō)明供試品在薄膜過(guò)濾法的檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì), 可照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行復(fù)方萘甲唑啉滴眼液的無(wú)菌檢查。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(二部).中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010：附錄XI H.

［2］張新妹, 胡昌勤, 趙霞, 等.注射用伏立康唑無(wú)菌檢查法的建立.天津藥學(xué), 2003, 15(5):9-11.