吸血類動(dòng)物組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

張志林

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連116081）

肖蓉，勾萌，李慶偉

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116081）

奇妙的自然界中生活著一群恐怖的 “吸血鬼”，有人們所熟悉的吸血?jiǎng)游铮绨次?、水蛭和血吸蟲等，也有令海洋中的 “吸血鬼”七鰓鰻。它們不僅依靠吸食動(dòng)物和人類的血肉為生，而且還會(huì)傳播慢性或致命疾病，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)和人類健康帶來極大危害。隨著人類和多種模式生物全基因組測序和基因功能注釋的逐步完成，龐大的基因組信息被源源不斷地挖掘出來，人們逐漸找到了預(yù)防和診斷這些疾病的方法，也在吸血?jiǎng)游锏耐僖合僦姓业搅艘恍┚哂锌鼓㈡?zhèn)痛以及抗炎等功能的活性成分。但是單純基因組信息并不能完全解決相關(guān)疾病的困擾，因?yàn)榛蛑皇沁z傳信息的攜帶者，蛋白質(zhì)才是機(jī)體生理功能的最終執(zhí)行者和疾病發(fā)生的核心。與相對(duì)穩(wěn)定的基因組不同，在內(nèi)外環(huán)境的作用下，蛋白質(zhì)組總是處于動(dòng)態(tài)變化過程，所以研究全部蛋白質(zhì)表達(dá)譜才能確切闡明細(xì)胞的生理功能狀態(tài)及疾病的病理演進(jìn)過程。因此，對(duì)吸血?jiǎng)游锏鞍踪|(zhì)組學(xué)的深入研究將有助于了解吸血過程中相關(guān)蛋白質(zhì)的變化情況，發(fā)掘功能蛋白，闡明疾病傳播的機(jī)制，為特異生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的篩選和鑒定提供有效依據(jù)。綜述了吸血?jiǎng)游锏鞍踪|(zhì)組學(xué)的主要研究內(nèi)容和手段，以及吸血過程中各組織蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)變化及其潛在的臨床應(yīng)用意義。

1 吸血類動(dòng)物蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究范疇及手段

吸血類動(dòng)物蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究范疇包括3個(gè)方面：①功能蛋白質(zhì)組學(xué)：主要是對(duì)吸血類動(dòng)物唾液腺中的活性蛋白質(zhì)組分進(jìn)行鑒定并詳細(xì)闡述其主要功能；②差異蛋白質(zhì)組學(xué)，即比較蛋白質(zhì)組學(xué)：比較吸血類動(dòng)物在生理和病理過程中蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化；③相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)：主要是研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，繪制某個(gè)體系的蛋白質(zhì)間相互作用和聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)圖譜［1］（圖1）。其中，差異蛋白質(zhì)組學(xué)是研究吸血類動(dòng)物蛋白質(zhì)組學(xué)的重點(diǎn)。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要手段有：以雙向凝膠電泳為核心的蛋白質(zhì)組分分離技術(shù)和以質(zhì)譜為代表的蛋白質(zhì)組分鑒定技術(shù)，以及蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)等。

吸血?jiǎng)游飶募闹餮褐屑橙I養(yǎng)并傳播疾病，它們的唾液腺、中腸、血液和排泄分泌物中可能含有一些致病分子，以及一些具有抗凝、鎮(zhèn)痛、免疫防御等功能的活性成分，作為其對(duì)抗天敵的重要武器。其中部分活性物質(zhì)已經(jīng)應(yīng)用于臨床疾病的治療（如：水蛭素、吸血蝠唾液酶）［2］。

2 吸血類動(dòng)物唾液腺蛋白質(zhì)組學(xué)研究

吸血?jiǎng)游餅榱顺晒乃拗魑⊙盒枰朔幌盗姓系K：必須刺穿皮膚，快速完成吸血過程，逃避宿主的排斥反應(yīng)以及抑制宿主的凝血、疼痛和炎癥反應(yīng)等等。它們的唾液腺應(yīng)含有一些具有抗凝等功能的活性成分，如血小板聚集抑制因子、抗凝因子、血管擴(kuò)張因子等。這些活性成分將有助于保證吸血?jiǎng)游镂^程的順利進(jìn)行。

圖1 蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法及技術(shù)路線

2.1 按蚊唾液腺蛋白質(zhì)組學(xué)研究

唾液腺是按蚊的重要器官，不僅有助于消化攝入的糖分及血液，同時(shí)也能傳播疾病并引起局部的變態(tài)反應(yīng)。2012年Narissara等人通過SDS－PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)：按蚊（Anopheles barbirostris）在叮咬期間、吸血中，以及吸血后，其唾液腺蛋白質(zhì)組分的表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)，甚至消失［3］。這些表達(dá)水平發(fā)生改變的蛋白質(zhì)組分包括：組胺結(jié)合蛋白（Long for m D7），血管舒張劑（Peroxidase），凝血酶抑制劑（Serpin protease inhibitor）、抗血小板凝集因子（Anopheline antiplatelet pr otein）、免疫調(diào)節(jié)劑（Adenosine deaminase）等。這些活性組分可通過吸血過程流入到宿主體內(nèi)從而抑制宿主的凝血及炎癥反應(yīng)等，并傳播病原體。2012年，WASS等對(duì)按蚊唾液腺的抽提物進(jìn)行了胰蛋白酶酶解［4］，然后采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI－TOF－MS）對(duì)其肽段進(jìn)行了鑒定。序列分析結(jié)果表明按蚊唾液腺除了含有能夠抑制宿主凝血過程所需的活性蛋白質(zhì)或多肽，如抗凝血（Ser pin超家族蛋白）、抗血小板聚集（Apyrase）和血管舒張因子（Tyrosinase）等生物活性成分，還含有抑制宿主免疫防御的蛋白質(zhì)，如腺苷脫氨酶（Adenosine deaminase，ADA）等。它能夠通過水解腺苷為次黃苷從而抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，最終起到免疫逃逸的作用。然而，由于按蚊唾液腺蛋白質(zhì)含量較低，目前的研究多集中于與吸血相關(guān)的蛋白質(zhì)的生物功能上［5］。

2.2 水蛭唾液腺蛋白質(zhì)組學(xué)研究

水蛭具有多種藥理活性，其應(yīng)用前景非常廣闊。2004年，Baskova等首先運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)歐洲醫(yī)蛭（Hir udo medicinalis）唾液腺分泌物進(jìn)行了分析鑒定［6］。研究發(fā)現(xiàn)歐洲醫(yī)蛭唾液腺分泌物中共含有100多種蛋白質(zhì)，通過質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)水蛭唾液腺分泌物中除了含有熟知的水蛭素（Hirudin）以外，還含有多種生物活性成分：如類胰蛋白酶抑制劑（Tryptase inhibitor）、胰蛋白酶抑制劑（Trasylol）、乳清酸（Saratin）、溶菌酶（Destabilase－lysozy me）、透明質(zhì)酸酶（Hyal uronidase）、膠原誘導(dǎo)型血小板聚集抑制劑（Calin）、谷?；D(zhuǎn)肽酶（γ－Glutamyl transpeptidase）、凝血因子Xa抑制劑（Antistasin）、血小板糖蛋白拮抗劑（Decorsin）以及能夠降解血栓（富含血小板）的蛋白（Hementin）等［7］。2007年，Baskova等利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)不同季節(jié)不同月份的歐洲醫(yī)蛭唾液腺分泌物進(jìn)行了分析和鑒定［8］。研究發(fā)現(xiàn)，歐洲醫(yī)蛭唾液腺組分中抗凝血酶活性隨季節(jié)發(fā)生改變，冬季活性最強(qiáng)，且水蛭素只有在冬季才能被檢測出來。2012年，Abbas等對(duì)不同月份的馬來西亞水蛭（Hir udinaria Manillensis）進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析［9］。研究發(fā)現(xiàn)：在5月，馬來西亞水蛭唾液腺的抗凝血酶活性最強(qiáng)，最弱是在11月至1月。因此，作者認(rèn)為：①不同種屬水蛭唾液腺組分不同并且會(huì)隨著外界環(huán)境、時(shí)間的變化而發(fā)生變化；②水蛭體內(nèi)能產(chǎn)生抗凝活性成分以幫助水蛭吸取寄主血液并儲(chǔ)存在體內(nèi)，且不會(huì)發(fā)生凝血反應(yīng)。除此之外，在水蛭的蛋白質(zhì)組學(xué)研究過程中，還有很多低分子量多肽組分尚未被分離和鑒定，亟待進(jìn)一步的分析與研究。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段深入研究水蛭唾液腺的蛋白質(zhì)組分可為闡明水蛭的藥理學(xué)活性和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，具有較好的市場開發(fā)應(yīng)用前景。

2.3 蜱類唾液腺蛋白質(zhì)組學(xué)研究

唾液腺是蜱類體內(nèi)最大的器官，能夠維持體內(nèi)離子、水分平衡，抑制寄主的凝血反應(yīng)，并傳播各類疾病。有文獻(xiàn)報(bào)道，蜱類唾液腺組分中含有大量的抗凝血分子（Tcik anticoagulant peptide）、抗血小板聚集分子（Triplatin）、層粘連蛋白（Laminin）、蛋白酶抑制劑（Serpin protease inhibitor）［10］、蛋白酶（Aminopeptidase、Car boxylesterase、Adipose triacyl glyceride lipase、Super oxide dismutase），以及免疫調(diào)節(jié)分子（Thioredoxin）和神經(jīng)麻痹毒素（HT－1、HT－2、HT－3）［11］。因此，深入研究蜱類唾液腺蛋白質(zhì)組成員可為探索蜱類相關(guān)傳染病的傳播機(jī)制和尋找新型生物制劑提供重要的理論基礎(chǔ)。2005年，Lu等采用生物化學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等多學(xué)科交叉的前沿方法，對(duì)不同發(fā)育期的長角血蜱（Haemaphysalis l ongicor nis）唾液腺蛋白質(zhì)含量與成分的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了比較分析［12］。研究發(fā)現(xiàn)雌性長角血蜱唾液腺在饑餓期蛋白質(zhì)含量最低，吸血初期含量明顯升高，到交配期達(dá)到最大值，飽血后蛋白質(zhì)含量開始下降，到飽血后第4天急劇下降至原始水平。這一變化趨勢與雌蜱的附著、吸血、交配和飽血等寄生期的特點(diǎn)相一致。此外，經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)Lu等發(fā)現(xiàn)凝膠上有6個(gè)蛋白點(diǎn)在不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)模式不同，可以分為兩類：第一類蛋白質(zhì)表現(xiàn)為在饑餓期和吸血期不存在，在交配期開始出現(xiàn)，在飽血期當(dāng)天表達(dá)量增至最大。第二類蛋白質(zhì)表現(xiàn)為在饑餓期存在，在吸血期表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)，在交配期表達(dá)量增至最大，飽血期含量開始下降。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示第一類蛋白質(zhì)為：熱激基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（COG1420）、琥珀酰－輔酶A合成酶β亞基和一種與產(chǎn)熱有關(guān)的蛋白質(zhì)（CG17514，is form A）；第二類蛋白質(zhì)為：絲氨酸蛋白激酶（Serine protein kinase）、免疫球蛋白（Similar to Drosophila melanogaster PebⅢ）和依賴DNA的RNA聚合酶Ⅱ亞基［13］。后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所有這些蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化都與蜱類吸血過程密切相關(guān)［14］。然而不足的是所鑒定的差異蛋白點(diǎn)只是少數(shù)含量相對(duì)豐富的蛋白質(zhì)。因此，還迫切需要鑒定蜱類唾液腺中的低豐度蛋白質(zhì)以進(jìn)一步闡明蜱類吸血及傳播疾病的分子機(jī)制。

3 吸血?jiǎng)游镏心c蛋白質(zhì)組學(xué)研究

3.1 按蚊中腸蛋白質(zhì)組學(xué)研究

攜帶有瘧原蟲的蚊子在吸食人血的過程中會(huì)傳播瘧疾。瘧原蟲在侵染按蚊時(shí)，其雄性和雌性的配子細(xì)胞會(huì)在按蚊的中腸內(nèi)完成受精過程并形成合子。因此，1998年P(guān)revot等在研究瘧原蟲侵染按蚊機(jī)制的時(shí)候，把中腸作為重點(diǎn)研究對(duì)象，對(duì)瘧原蟲侵染不同品系的按蚊中腸做了蛋白質(zhì)組學(xué)分析［15］，試圖在其中腸中篩選參與調(diào)控瘧原蟲卵囊黑化作用的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。研究結(jié)果表明，按蚊在被瘧原蟲感染之前，其瘧原蟲易感品系和抗性品系中腸組織的雙向電泳圖譜差異較小；但是，按蚊在被瘧原蟲感染之后第3天，其瘧原蟲抗性品系中腸的雙向電泳圖譜出現(xiàn)了一條分子量約為67k Da的蛋白條帶，且該蛋白質(zhì)濃度隨著感染時(shí)間的延長而增加，而其易感品系的雙向電泳圖譜卻沒有發(fā)生明顯變化。質(zhì)譜鑒定此蛋白質(zhì)為前酚氧化酶（Prophenoloxidase，PPO）［16］，能夠通過介導(dǎo)卵囊黑化包裹反應(yīng)從而激活按蚊的先天性免疫防御系統(tǒng)。2000年，Chun等采用冷激或注射等手段刺激瘧原蟲易感和抗性品系的按蚊，并對(duì)其中腸雙向電泳圖譜中發(fā)生差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)刺激后按蚊絲氨酸蛋白酶（AgSpl4D1）的表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)［17］。序列分析結(jié)果表明該蛋白質(zhì)與果蠅的脂酶和煙青蟲的酚氧化酶極為相似。后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)AgSpl4D1能夠通過誘導(dǎo)按蚊體液分泌黑色素，并協(xié)同具有細(xì)胞毒性的醌類中間產(chǎn)物沉積到入侵的病原體周圍，從而起到隔離殺死病原體的作用［18］。此外，Prevot等研究發(fā)現(xiàn)雌按蚊和雄按蚊在添食糖水后，其中腸雙向電泳圖譜差異很?。欢谔硎逞汉?，雌按蚊中腸雙向電泳圖譜比雄按蚊多出8個(gè)特異性蛋白點(diǎn)。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示這8個(gè)特異性蛋白點(diǎn)能夠參與雌按蚊的吸血、免疫防御和炎癥反應(yīng)，并在繁殖等生理過程中發(fā)揮重要作用［19］。目前，已有研究團(tuán)隊(duì)陸續(xù)采用蛋白質(zhì)組學(xué)手段從瘧疾傳播媒介－按蚊體內(nèi)大規(guī)模高通量篩選出與瘧疾傳播相關(guān)的特異性抗原成分，隨后利用分子及免疫技術(shù)制備降低蚊蟲生存力和生育力的疫苗，從而達(dá)到阻斷蚊蟲傳播疾病的目的。

3.2 扇頭牛蜱中腸蛋白質(zhì)組學(xué)研究

蜱類疫苗被認(rèn)為是控制蜱類吸血和相關(guān)疾病傳播最為有效的方法。目前市面上商業(yè)化的疫苗僅有兩種，主要成分是蜱類中腸膜的重組蛋白（Tick Gard和Grave）。蜱類中腸不僅能快速消化血液，還具有極強(qiáng)的抗病能力。因此，對(duì)蜱類中腸蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究能夠?yàn)橐呙绲拈_發(fā)提供更為重要的理論依據(jù)。2009年Kritaya等對(duì)扇頭牛蜱（Rhipicephal us sanguineus） 的 中腸進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，共發(fā)現(xiàn)134種蛋白質(zhì)，并按生物學(xué)功能對(duì)其進(jìn)行了分類（圖 2）［20］。此外，在吸血過程中其中腸雙向電泳圖譜含有15個(gè)分子量相同、p H值不同的蛋白質(zhì)。Kritaya認(rèn)為這15個(gè)蛋白質(zhì)為同種蛋白質(zhì)的不同亞型。質(zhì)譜鑒定和后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這15個(gè)蛋白質(zhì)與能量代謝和蛋白質(zhì)的折疊戚戚相關(guān)。它們分別是3種乙醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase）、3種蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（Pr otein disulfide iso merase）、3種泛醌－細(xì)胞色素 C（ubiquinol－cytochro me c）、2種 ATP5 A1綜合酶（ATP synthase H＋transporting atp5 A1）、2種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白（Endoplasmic reticulu m resident protein 29－like），以及3種細(xì)胞膜孔蛋白（Porin）［21］。這些蛋白質(zhì)被認(rèn)為是蜱類疫苗的潛在作用靶點(diǎn)，可利用RNA干擾等技術(shù)控制蜱類食物消化和病原體繁殖等生命過程。

圖2 扇頭牛蜱中腸功能蛋白質(zhì)分析

4 吸血?jiǎng)游镅旱鞍踪|(zhì)組學(xué)研究

血液中富含多種蛋白質(zhì)組分。在某些病理狀態(tài)下，機(jī)體會(huì)分泌一些關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)或應(yīng)激蛋白質(zhì)到血液中，最終導(dǎo)致血液中總蛋白質(zhì)成分發(fā)生質(zhì)或量的變化。因此，比較分析正常與異常狀態(tài)下血液的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，尋找發(fā)生差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)并進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能鑒定，最終獲得相應(yīng)的生物標(biāo)志物和（或）藥物作用靶點(diǎn)，已成為疾病監(jiān)測、新藥開發(fā)、藥理毒理學(xué)研究的重要手段。

按蚊血液中富含的血淋巴就是其重要的非特異性免疫器官，對(duì)多種病原物具有很強(qiáng)的抵抗能力。為了從中找到一些具有廣譜抗菌或抗病毒等活性的成分，2005年P(guān)askewitz等人利用雙向電泳、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI－TOF－MS）的方法對(duì)瘧原蟲侵染前后的按蚊血液進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究［22］。研究發(fā)現(xiàn)，按蚊血液的雙向電泳圖譜約含有280個(gè)蛋白點(diǎn)，對(duì)其中豐度較高的28個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行了分析鑒定，共獲得了26個(gè)不同的蛋白質(zhì)的序列。分析結(jié)果表明這些蛋白質(zhì)主要參與按蚊的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)和脂類的生理代謝等活動(dòng)。按蚊在感染細(xì)菌后，其血液中的酚氧化酶和兩個(gè)類幾丁質(zhì)酶的表達(dá)水平明顯發(fā)生上調(diào)。后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該蛋白酶主要通過參與黑化包裹瘧原蟲的過程從而起到抵抗病原物的作用。此外，血液中轉(zhuǎn)鐵蛋白等的表達(dá)水平則發(fā)生明顯的下調(diào)，推測與按蚊體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)［23］。由于血清中富含多種蛋白質(zhì)組分，因此，若在復(fù)雜的血清組分中發(fā)現(xiàn)針對(duì)相關(guān)疾病的靶標(biāo)分子，可對(duì)疾病的診治起事半功倍的效果。2010年Shen等利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法從日本血吸蟲成蟲血清內(nèi)篩選出4種蛋白質(zhì)：亮氨酸氨基肽酶（Sj LAP）、果糖二磷酸醛縮酶（Sj FBPA）、26 k Da谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Sj GST）和22.6 k Da血吸蟲表膜主要蛋白（Sj22.6）。其中，Sj LAP和Sj FBPA可作為指示工具去診斷慢性血吸蟲病。2011年Chaerkady等研究發(fā)現(xiàn)，按蚊受到機(jī)械性傷害后，一些不含信號(hào)肽的代謝相關(guān)酶類（淀粉酶、水解酶、脂酶、胰蛋白酶）會(huì)發(fā)生上調(diào)反應(yīng)［24］。因此，采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段可于短時(shí)間內(nèi)從整體水平獲得大量表達(dá)水平發(fā)生改變的蛋白質(zhì)，為今后研究微生物感染按蚊的機(jī)制提供了良好的參考。

5 吸血?jiǎng)游锱判狗置谖锏鞍踪|(zhì)組學(xué)研究

吸血?jiǎng)游镌诩纳^程中通常會(huì)向宿主體內(nèi)排泄、分泌一些能夠干擾宿主免疫反應(yīng)過程的活性分子，從而使其可以逃脫宿主的免疫攻擊。因此，開展對(duì)吸血?jiǎng)游锱判狗置谖锏鞍踪|(zhì)組學(xué)的研究，將有助于了解免疫逃避分子機(jī)制，研制新的預(yù)防疫苗和新的診斷方法。

血吸蟲在終末宿主體內(nèi)完成其生活史的過程中，可通過其體表、腸上皮表面或者是其它器官釋放分泌物，以免疫模擬方式來干擾宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。血吸蟲寄生于人畜體內(nèi)會(huì)嚴(yán)重危害人畜健康，而目前市面上可治療的藥物只有吡喹酮（Praziquantel），但該藥物對(duì)重復(fù)感染束手無策，亟需改善。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)高通量篩選并鑒定血吸蟲排泄分泌物中的蛋白質(zhì)組分不僅有助于揭示血吸蟲調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)、建立慢性感染的機(jī)制，還為篩選抗血吸蟲感染的疫苗候選分子，藥物靶標(biāo)和診斷抗原提供理論依據(jù)。到目前為止，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道日本血吸蟲（Schistosoma j aponicu m）各個(gè)發(fā)育時(shí)期排泄分泌物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。2004年，Cur wen等對(duì)曼氏血吸蟲（Schistosoma mansoni）的尾蚴、童蟲、成蟲、未成熟卵，以及成熟卵進(jìn)行了可溶性蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并成功鑒定出84種蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)主要在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，蛋白折疊、修飾和合成，核酸合成，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肌肉發(fā)育，以及電子傳遞等方面發(fā)揮重要作用。差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示各蟲體階段共同表達(dá)的蛋白質(zhì)比發(fā)生差異表達(dá)的蛋白質(zhì)含量高。這些高豐度的蛋白質(zhì)分別是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、脂肪酸結(jié)合蛋白，以及腺苷酸激酶。它們?cè)谘x的傳播及發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。2009年Feng等人采用蛋白質(zhì)組學(xué)手段研究發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲尾蚴的排泄分泌物中含有Actin等結(jié)構(gòu)肌動(dòng)蛋白、甘油醛－3－磷酸脫氫酶等能量代謝相關(guān)酶類、14－3－3蛋白等信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)分子、HSP70家族等相關(guān)熱休克蛋白，以及20s蛋白酶體等五類功能蛋白［25］。序列分析和后續(xù)試驗(yàn)證明這些成分有利于尾蚴以皮膚滲透方式入侵宿主，并逃避其體內(nèi)的免疫反應(yīng)。在血吸蟲童蟲時(shí)期，排泄分泌物中的組分則主要參與機(jī)體細(xì)胞代謝、應(yīng)激反應(yīng)，以及生長發(fā)育等過程［26］。2009年Liu等在日本血吸蟲成蟲的排泄分泌物中鑒定出大量的脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty acid binding protein）和少量的熱休克蛋白（HSP70、HSP90、HSP97）、肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、氨肽酶（Aminopeptidase）、烯醇化酶（Enolase）以及甘油醛－3－磷酸脫氫酶等。后續(xù)分析結(jié)果表明這些蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用［27］。此外，2009年Steinfel der等還在日本血吸蟲蟲卵的排泄分泌物中發(fā)現(xiàn)了高豐度的、能特異性引起Th2細(xì)胞極化的糖蛋白（Omega－1）。除此之外，抗菌蛋白（CAP18）、硫氧還蛋白過氧化物酶（Thioredoxin per oxidase），分子伴侶（Heat Shock Pr oteins）和信號(hào)通路相關(guān)蛋白（14－3－3蛋白、GTP－結(jié)合蛋白、肌鈣網(wǎng)蛋白）等也同時(shí)被鑒定出來［28］。這些結(jié)果為進(jìn)一步闡明血吸蟲的致病機(jī)制提供了重要的信息，為下一步阻斷或抑制血吸蟲的發(fā)育傳播以及緩解病情奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

6 吸血?jiǎng)游锟谇幌俚鞍踪|(zhì)組學(xué)研究

七鰓鰻（La mpetr a j aponica）是迄今所知的最原始的無頜類脊椎動(dòng)物，是研究適應(yīng)性免疫系統(tǒng)起源與進(jìn)化，系統(tǒng)發(fā)育的優(yōu)良動(dòng)物模型。此外，七鰓鰻還具有非常特殊的半寄生生活方式，即依靠吸食宿主魚體的血肉為生。Li等人根據(jù)已構(gòu)建好的七鰓鰻口腔腺c DNA文庫成功克隆出七鰓鰻吸血過程中的重要功能基因［29］，如富含半胱氨酸分泌蛋白（Cysetine rich secretory protein）、具有纖維蛋白原水解酶活性的BGSP－1（Buccal gland secretion pr otein－1）、Per oxiredoxin（Pr x），含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸的短肽序列（Arg－Gly－Asp，RGD）等［30］。然而目前國內(nèi)外尚無關(guān)于七鰓鰻蛋白質(zhì)組學(xué)的研究工作。本課題組擬率先采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段分析七鰓鰻的口腔腺、血清、髓樣，以及肝臟等組織。大規(guī)模、高通量的篩選鑒定一些與其組織器官的系統(tǒng)發(fā)育，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)起源，以及與抗凝、抗炎和鎮(zhèn)痛等功能相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，這將為海洋生物資源的保護(hù)與開發(fā)以及新型藥物的研制帶來極大的推動(dòng)作用。

7 展望

隨著人類基因組計(jì)劃（Hu man Geno me Project）的完成，生命科學(xué)研究已進(jìn)入后基因組時(shí)代，其標(biāo)志之一就是蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）的興起。蛋白質(zhì)組學(xué)作為重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，已經(jīng)成為人們篩選重大疾病的特異生物標(biāo)志物和研究發(fā)病機(jī)理的新途徑。對(duì)吸血?jiǎng)游锏耐僖合?、中腸、血液、排泄分泌物，以及口腔腺等組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅有助于尋找和篩選具有特殊功能的生物活性分子，還為闡明某些因寄生行為而引起的疾病的致病機(jī)制奠定良好的理論基礎(chǔ)。這可為今后應(yīng)用于寄生動(dòng)物引起的疾病的預(yù)防、早期診斷、臨床治療和疫苗研發(fā)等方面提供有利的數(shù)據(jù)支撐。

雖然運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究人員已從吸血?jiǎng)游锏耐僖合?、中腸、血液、排泄分泌物，以及口腔腺等組織中發(fā)現(xiàn)了大量的生物活性成分以及一些引起疾病的關(guān)鍵分子，但是還有很多低豐度的功能蛋白質(zhì)仍未被鑒定出來。發(fā)展高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺(tái)仍是今后相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要任務(wù)。相信隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，國際間的學(xué)術(shù)合作及資源交流的不斷加強(qiáng)，全球共享數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)的不斷完善，越來越多的低豐度重要功能分子將被挖掘出來，為人類健康提供更有價(jià)值的理論參考。

［1］Zhang A，Sun H，Wang P，et al.Salivary proteomics in biomedical research ［J］.Clin Chi m Acta，2013，415：261－265.

［2］Ohtsuki S.Novel approach for biochemistr y by quantitative tar geted proteo mics：new protein quantification met hod wit hout using antibodies ［J］.Seikagaku，2012，84（11）：911－919.

［3］Narissara J，Sittir uk R，Atchara P，et al.Proteo mic analysis of salivary glands of female Anopheles bar bir ostris species A2（Diptera：Culicidae）by two－di mensional gel electrophoresis and mass spectr o metry ［J］.Parasitol Res，2012，111：1239－1249.

［4］Wass MN，Stan way R，Blagbor ough A M，et al.Proteo mic analysis of Plas modiu m in the mosquito：progress and pitfalls ［J］.Parasit ology，2012，43：1131－1145.

［5］Kalu me DE，Okulate M，Zhong J，et al.A proteomic analysis of salivary glands of female Anopheles gambiae mosquito ［J］.Proteo mics，2005，5（14）：3765－3777.

［6］Baskova IP，Zavalova LL，Basanova AV，et al.Pr otein Profiling of the Medicinal Leech Salivar y Gland Secretion by Pr oteo mic Analytical Methods［J］.Biochemistry（Moscow），2004，27：945－951.

［7］Baskova IP，Kostrjukova ES，Valsova MA，et al.Pr oteins and Peptides of the Salivar y Gland Secretion of Medicinal Leeches Hir udo ver bena，H.medicinalis，and H.orientalis［J］.Biochemistr y（Mosco w），2008，38：388－394.

［8］Baskova IP，Zavalova LL，Kostrjukova ES，et al.Proteomic Analysis Methods for Characterization of Proteins from the Salivary Gland Secretions of the Medicinal Leech during Different Seasons ［J］.Bioche mistry（Moscow），2007，35：219－225

［9］Abbas G，Abdualrah man A，Ah med M，et al.Season Variation and Starvation Period Influence on the Antithrombotic Activity of Leech Saliva Extract Fr o m the Medicinal Malaysian Leech Hir udinaria Manillensis ［J］.Bioequivalenc ＆Bioavailability，2012（Sup）：14－23.

［10］Daniel E，Sonenshine DE，Bissinger BW，et al.First Transcripto me of the Testis－Vas Deferens－Male Accessory Gland and Pr oteo me of the Sper matophore fr o m Der macentor variabilis（Acari：Ixodidae）［J］.PLo S One，2011，6（9）：e24711.

［11］Tucker A M，Driskell LO，Pannell LK，et al.Differential Pr oteo mic Analysis of Rickettsia prowazekii Pr opagated in Diverse Host Backgr ounds ［J］.Applied and Envir on mental Micr obiology，2011，86：4712－4718.

［12］Lu X，Che Q，Lv Y，et al.A novel defensin－like peptide from salivary glands of the hard tick，Haemaphysalis longicornis ［J］ .Protein Sci，2010，19（3）：392－397.

［13］Hajem N，Weintraub A，Ni mtz M，et al.A study of the antigenicity of Rickettsia helvetica proteins using two－di mensional gel electrophoresis［J］.APMIS，2009，117（4）：253－262.

［14］Jindrich C，Eric C，Joao HF，et al.Tick salivary secretion as a source of antihe mostatics ［J］.Jour nal of pr oteo mic，2012，75：3842－3854.

［15］Prévot GI，Laurent－Winter C，F(xiàn)eld mann A M，et al.Two－di mensional gel analysis of midgut proteins of Anopheles stephensi lines with different susceptibility to Plasmodiu m falciparu m infection ［J］.Insect molecular biology，1998，7（4）：375－383.

［16］Qiu ZW，Zhang XL，Xu WY.Changes of prophenoloxidase in the midguts of Anopheles stephensi and Anopheles dirus bef ore and after infection with plas modiu m yoelii［J］ .Acta academiae medicinae militaris tertiae，2004，26（6）：490－493.

［17］Chun J，Mc Master J，Han Y，et al.Two－di mensional gel analysis of haemoly mph pr oteins fro m Plas modiu m－melanizing and non－melanizing strains of Anopheles gambiae ［J］.Insect Mol Biol，2000，9（1）：39－45.

［18］PeiZhi H，Kai W，Hong Xia M，et al.Application prospect of anticoagulant substances fro m mosquit oes on phar macology ［J］.Chinese Veterinar y Science，2009，39（9）：839－842.

［19］Prévot GI，Laurent－Winter C，Rodhain F，et al.Sex－specific and blood meal－induced pr oteins of Anopheles gambiae midguts：analysis by two－di mensional gel electr ophoresis ［J］.Malaria Jour nal，2003，11：2－11.

［20］Kongsu wan K，Josh P，Zhu Y，et al.Exploring the midgut proteo me of partially fed female cattle tick（Rhipicephalus（Boophilus）micr oplus）［J］.Jour nal of Insect Physiology，2010，56（2）：212－226.

［21］Villar M，Popara M，Bonzón－Kulichenko E，et al.Characterization of the tick－pat hogen interface by quantitative pr o teo mics ［J］.Ticks and Tick－bor ne Diseases，2012，3（3）：154－158.

［22］Paskewitz S，Dickinson K.Willingness to pay for mosquito control：how i mportant is West Nile vir us risk co mpared to the nuisance of mosquitoes？［J］.Vector Bor ne Zoonotic Dis，2012，12（10）：886－892.

［23］Paskewitz SM，Shi L.The he moly mph proteo me of Anopheles ga mbiae ［J］.Insect Bioche m Mol Biol，2005，35（8）：815－824.

［24］Chaer kady R，Kel kar DS，Mut husamy B，et al.A pr oteogeno mic analysis of Anopheles gambiae using high－resolution Fourier transf or m mass spectr o metr y ［J］ .Geno me Res，2011，21（11）：1872－1881.

［25］Liu F，Cui SJ，Hu W，et al.Excretory／Secretor y Proteo me of the Adult Develop mental Stage of Hu man Blood Fluke，Schistoso ma japonicu m ［J］ .Molecular ＆Cell ular Pr oteo mics，2009，8（6）：1236－1251.

［26］Verjovski－Al meida S，De Marco R.Current develop ments on Schistoso ma proteo mics ［J］.Acta Tr op，2008，108（2／3）：183－185.

［27］Liu F，Lu J，Hu W，et al.New perspectives on host－parasite inter play by co mparative transcripto mic and pr oteo mic analyses of Schist oso ma japonicu m ［J］.Plos Pat hog，2006，2（4）：29.

［28］Steinfelder S，Andersen JF，Cannons JL，et al.The major co mponent in schistoso me eggs responsible for conditioning dendritic cells for Th2 polarization is a T2 ribonuclease（o mega－1）［J］.J Exp Med，2009，206（8）：1681－1690.

［29］Rong X，Pang Y，Li QW.The buccal gland of Lampetra japonica is a source of diverse bioactive pr oteins ［J］ .Biochi mie，2012，94（5）：1075－1079.

［30］Wang J，Han X，Yang H，et al.A novel RGD－toxin pr otein，Lj－RGD3，from the buccal gland secretion of La mpetra japonica impacts diverse biological activities ［J］.Biochi mie，2010，92（17）：1387－1396.