Wnt誘導(dǎo)分泌蛋白－1與克羅恩病腸壁纖維化關(guān)系的臨床研究

徐正磊，王立生，梅 毅，廖碧紅，師瑞月，張 茹

(廣東省深圳市人民醫(yī)院，廣東深圳518000)

克羅恩病(CD)是一種胃腸道慢性非干酪性肉芽腫性炎癥，病變可以累及腸壁全層，腸壁增厚變硬，腸腔狹窄［1］。腸腔狹窄后容易出現(xiàn)腸梗阻，腸梗阻的大部分患者需要外科手術(shù)治療，而且手術(shù)后容易復(fù)發(fā)。腸壁纖維組織增生引起的腸壁纖維化是腸壁增厚變硬、腸腔狹窄的重要原因［2］。目前CD腸壁纖維化的發(fā)生機(jī)制仍不完全清楚。研究顯示，TGF-β、TNF-α、CTGF、IGF-1和 ICAM-1等細(xì)胞遞質(zhì)在 CD 引起的腸壁纖維化過(guò)程中起到重要的作用。最新研究表明，Wnt誘導(dǎo)分泌蛋白-1(WISP-1)與肺、心臟、肝臟等器官的纖維化相關(guān)［3］。本研究探討了WISP-1與CD腸壁纖維化的關(guān)系，為CD合并纖維化的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2012年3月—2013年3月本院收治的CD合并腸梗阻行手術(shù)患者20例作為CD組，選擇本院體檢部體檢健康的20例作為對(duì)照組。CD組病例均來(lái)自本院，并符合世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的CD診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］:在排除腸結(jié)核、阿米巴痢疾、耶爾森菌感染等慢性腸道感染、腸道淋巴瘤、憩室炎、缺血性腸炎、白塞病以及潰瘍性結(jié)腸炎等基礎(chǔ)上，同時(shí)具備下述①②③項(xiàng)再加上④⑤⑥之一項(xiàng);或者具有④項(xiàng)，再加上①②③中任意2項(xiàng)。①非連續(xù)性或區(qū)域性腸道病變;②腸黏膜成鋪路石表現(xiàn)，或有縱行潰瘍;③全層炎癥性腸道病變，伴有腫塊或狹窄;④結(jié)節(jié)病樣非干酪性肉芽腫;⑤裂溝或瘺管;⑥肛門(mén)病變，有難治性潰瘍、肛瘺或肛裂。排除肺、心臟和肝臟疾病，排除高血壓和糖尿病，無(wú)長(zhǎng)期服藥物及吸煙酗酒史。CD組男9例，女11例;年齡20～52(34.43±10.29)歲。對(duì)照組男8例，女12例;年齡22～50(35.25±9.63)歲。2組在性別、年齡方面比較無(wú)顯著性差異(P均＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法 ①檢測(cè)腸壁WISP-1。20例CD患者為節(jié)段性、跳躍性腸道病變，手術(shù)切除的腸道一般同時(shí)存在病變腸壁和正常腸壁，組織離體后30 min內(nèi)取材，一部分標(biāo)本經(jīng)液氮速凍后置于-70℃燙冰箱保存?zhèn)溆?，剩余?biāo)本經(jīng)甲醛固定用于制作石蠟塊。針對(duì)同一患者病變與正常腸壁，均采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法對(duì)WISP-1 mRNA表達(dá)水平做相對(duì)定量分析;采用免疫組化中的蛋白印跡法(Western-blot)檢測(cè)WISP-1蛋白表達(dá)水平。②檢測(cè)外周血WISP-1。提取所有受檢者的外周血標(biāo)本，均采用早晨空腹靜脈血;購(gòu)買(mǎi)人WISP-1 ELISA測(cè)定試劑盒，利用ELISA法測(cè)定外周血WISP-1水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，年齡、WISP-1水平等計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn);性別等計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 正常腸壁組與病變腸壁組WISP-1水平比較 病變腸壁組WISP-1 mRNA表達(dá)水平與WISP-1蛋白表達(dá)水平明顯高于正常腸壁組(P均＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 正常腸壁組與病變腸壁組WISP-1水平比較(±s)

表1 正常腸壁組與病變腸壁組WISP-1水平比較(±s)

組別 n WISP-1 mRNA表達(dá)水平 WISP-1蛋白表達(dá)水平正常腸壁組20 37.85 ±14.42 1.48 ±0.36病變腸壁組 20 26.53 ±9.26 1.01 ±0.09 t 4.382 3.944 P ＜0.05 ＜0.05

2.2 CD組與對(duì)照組血清WISP-1水平比較 CD組血清WISP-1 水平為(70.63 ±16.27)μg/L，明顯高于對(duì)照組的(56.53 ±10.62)μg/L(P ＜0.05)。

2.3 WISP-1 mRNA表達(dá)水平 見(jiàn)圖1和圖2。

2.4 WISP-1在CD病變腸壁中的表達(dá)情況 見(jiàn)圖3。

3 討 論

CD最早于1932年由 Crohn、Oppenheime和 Ginzterg描述，曾被稱為“慢性腸壁全層炎”、“節(jié)段性腸炎”、“局限性腸炎”等。1973年，WHO將該病命名為克羅恩?。?］。CD是一種消化道非特異性、慢性透壁性炎癥，病變呈節(jié)段性分布，病情反復(fù)發(fā)作，以回腸末端最為常見(jiàn)，另外，結(jié)腸和肛門(mén)病變也較多［6］。

CD可以導(dǎo)致大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的異常沉淀，從而導(dǎo)致腸壁全層均發(fā)生纖維化，從而引起狹窄，最終導(dǎo)致腸梗阻。有研究表明，40%以上CD有程度不等的腸梗阻，且反復(fù)發(fā)生，80%的患者最終需要手術(shù)治療［7］。目前CD的大部分治療藥物都不可逆轉(zhuǎn)已發(fā)生的腸壁纖維化，致使大部分患者需要外科手術(shù)或者內(nèi)鏡治療，但手術(shù)及內(nèi)鏡干預(yù)治療復(fù)發(fā)率高，并非最好的治療手段。

圖1 CD組腸壁組織中總mRNA提取物電泳圖

圖2 CD組WISP-1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

圖3 WISP-1在CD病變腸壁中的表達(dá)

近年研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥是腸壁纖維化的繼發(fā)因素之一［8］。炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，氧自由基等活性物質(zhì)的釋放進(jìn)一步激活成纖維母細(xì)胞分泌更多的膠原蛋白和彈性蛋白，在腸壁內(nèi)沉積，導(dǎo)致了腸壁的纖維化。CD是腸道的慢性炎癥，腸道間質(zhì)細(xì)胞活化為成纖維母細(xì)胞，導(dǎo)致大量ECM的異常沉淀［9］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在組織器官纖維化過(guò)程中起重要作用，如腎小管［10］、肝臟上皮細(xì)胞［11］、膽管上皮細(xì)胞［12］和腹膜間皮細(xì)胞［13］。④最新研究發(fā)現(xiàn)，WISP-1可能與CD的腸壁纖維化密切相關(guān)。WISP-1是Wnt信號(hào)通路活化后的下游靶基因之一，屬于高半胱氨酸蛋白61、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、腎母細(xì)胞瘤過(guò)度表達(dá)基因(CCN)家族成員，是一種富含半胱氨酸的長(zhǎng)度為367個(gè)氨基酸的分泌性蛋白多肽，其相對(duì)分子質(zhì)量約為40 000，可由成纖維母細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞合成分泌。WISP-1是促纖維化發(fā)生的主要細(xì)胞因子，WISP-1與細(xì)胞表面核心蛋白聚糖(DCN)結(jié)合后參與器官纖維化的發(fā)生。WISP-1在肺癌、肺纖維化、骨與軟骨形成及心肌梗死中都呈高表達(dá)，是這些疾病異常增生和纖維化的關(guān)鍵因子［13］。Sunita Sharma等［14］用基因篩選的方法首次發(fā)現(xiàn)WISP1同哮喘有關(guān)。Singanayagam［15］研究發(fā)現(xiàn)，WISP1作為一種新型的肺泡上皮細(xì)胞損傷和修復(fù)的調(diào)節(jié)因子，在促進(jìn)肺纖維化過(guò)程中起重要作用，拮抗WISP1可以抑制肺纖維化的發(fā)生。Lewis等［16］利用基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)博萊霉素導(dǎo)致的肺纖維化模型中WISP-1mRNA的表達(dá)水平顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Colston［17］行左前降支冠脈閉塞雄性小鼠心肌梗死造模，利用免疫印跡和Northern法檢測(cè)WISP-1的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)心肌組織中WISP-1的表達(dá)水平逐漸升高，在24 h達(dá)到最高峰;WISP-1可以促進(jìn)心肌中成纖維母細(xì)胞增殖及膠原合成;WISP-1促進(jìn)心肌成纖維母細(xì)胞增殖作用通過(guò)TNF-α介導(dǎo)，TNF-α通過(guò)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)依賴途徑誘導(dǎo)心肌成纖維母細(xì)胞WISP-1表達(dá)，TNF-α通過(guò)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1)/2誘導(dǎo)CREB活化，抑制ERK1/2和CREB，可以抑制TNF-α介導(dǎo)的WISP-1的表達(dá)，WISP-1基因沉默減弱TNF-α的促進(jìn)心肌成纖維母細(xì)胞增殖及膠原合成的作用。熊伍軍等［18］發(fā)現(xiàn)肝纖維化模型的肝組織中WISP-1的表達(dá)水平較正常組高11.6倍。

本研究結(jié)果顯示CD患者病變腸壁WISP-1 mRNA表達(dá)水平與WISP-1蛋白表達(dá)水平明顯高于正常腸壁，CD組患者血清WISP-1水平明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明WISP-1與CD的腸壁纖維化關(guān)系密切，其發(fā)生機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究，希望可以為CD腸壁纖維化的治療提供新的靶點(diǎn)。

［1］Adler J，Rahal K，Swanson SD，et al.Anti-Tumor Necrosis Factor α Prevents Bowel Fibrosis Assessed by Messenger RNA，Histology，and Magnetization Transfer MRI in Rats With Crohn＇s Disease［J］.Inflamm Bowel Dis，2013，2(20):376-379

［2］陳寧，劉玉蘭.克羅恩病腸道纖維化的發(fā)生機(jī)制和臨床治療［J］.世界華人消化雜志，2010，19(13):2017-2019

［3］李輝，宋佳，張曉嵐，等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β與炎性反應(yīng)腸病相關(guān)腸纖維化的關(guān)系［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，32(11):1364-1366

［4］樊華，鄭萍.克羅恩病與腸壁纖維化［J］.中華消化雜志，2008，28(1):66-68

［5］范燕云，王承黨.炎癥性腸病腸壁纖維化機(jī)制研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2010，16(18):2760-2764

［6］虞衛(wèi)華，許國(guó)強(qiáng).克羅恩病腸壁纖維化的發(fā)生機(jī)制和血清學(xué)指標(biāo)的變化［J］.國(guó)際消化病雜志，2009，4(17):235-237;263

［7］巫協(xié)寧，劉愛(ài)群.克羅恩病腸壁纖維化的檢測(cè)、意義和成因［J］.中華消化雜志，2007，27(3):210-211

［8］Pazahr S，Blume I，F(xiàn)rei P，et al.Magnetization transfer for the assessment of bowel fibrosis in patients with Crohn＇s disease:initial experience［J］.MAGMA，2012，11(9):410-415

［9］戴萌，李弼民.克羅恩病腸壁纖維化機(jī)制研究進(jìn)展［J］.世界華人消化雜志，2009，17(4):1117-1121

［10］Liu Y.New insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis［J］.J AM Soc Nephrol，2010，21(24):212-222

［11］吳冬.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在肝纖維化和肝細(xì)胞癌發(fā)病中的作用研究進(jìn)展［J］.實(shí)用肝臟病雜志，2011，14(6):475-477

［12］Wells RG.The epithelial-to-mesenchymal transition in liver fibrosis:here today，gone tomorrow［J］.Hepatology，2010，51(3):737-740

［13］Barbara Berschneider，Melanie K?nigshoff.WNT1 inducible signaling pathway protein 1(WISP1):A novel mediator linking development and disease［J］.The International Journal of Biochemistry ＆Cell Biology，2011，43(3):306-309

［14］Sunita Sharma，Kelan Tantisira，Vincent Carey.A role for wnt signaling genes in the pathogenesis of impaired lung function in asthma［J］.Am J Respir Crit Care Med，2010，181(4):328-336

［15］Singanayagam A.Lung alert:WISP-1，a novel target for treatment of pulmonary fibrosis［J］.Thorax，2009，64:875

［16］Lewis CC，Yang JY，Huang X，et al.Disease-specific gene expression profiling in multiple models of lung disease［J］.Am J Respir Crit Care Med，2008，177(58):376-387

［17］Colston JT，de la Rosa SD，Koehler M，et al.Wnt-induced secreted protein-1 is a prohypertrophic and profibrotic growth factor［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293(122):1839-1846

［18］熊伍軍，何益，劉菲，等.Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子在肝纖維化中的表達(dá)水平變化及其意義［J］.中華消化雜志，2008，28(9):612-616