退黃合劑對ANIT致膽汁淤積性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究*

陳新瑜 李小清 況 舸 陳蓉春 胡文艷 龔 霞 萬敬員△

（1.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016）

膽汁淤積性肝炎是由于多種原因引起的膽汁分泌或排泄障礙，導(dǎo)致膽紅素增高，最終出現(xiàn)肝細(xì)胞變性或壞死。其作為臨床上最常見的肝炎之一，在中醫(yī)學(xué)中屬于“黃疸”范疇。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對其無特異性治療手段，而中醫(yī)在黃疸的治療方面有其獨(dú)特的療效。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，濕邪是黃疸最主要的病因，無論陽黃，陰黃的發(fā)生均有濕邪內(nèi)蘊(yùn)，因此，清熱利濕、疏利肝膽成為退黃的關(guān)鍵所在。退黃合劑是根據(jù)劉華寶教授經(jīng)驗(yàn)方制成的合劑，該合劑由茵陳蒿、大黃、平地木、田基黃、蘇木、瞿麥6味中藥組方，具有清熱利濕、化瘀退黃之功，使?jié)裥皬亩愣?，諸藥合用，相須相使，相得益彰，共奏退黃之效而無損脾胃之弊［1］。本實(shí)驗(yàn)擬以ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷為模型，研究退黃合劑對其保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康清潔級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK（渝）20070001。

1.2 藥物與試劑 退黃合劑（規(guī)格1 g/mL，產(chǎn)品批號13090902）由重慶市中醫(yī)院制劑室提供，異硫氰酸-1-萘酯（ANIT）為上海阿拉丁公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （AST）、 堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、髓過氧化物酶（MPO）和超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；ECL化學(xué)發(fā)光和BCA蛋白定量試劑盒（美國pierce公司），大鼠巨噬細(xì)胞炎性蛋白（MIP）-2 ELISA檢測試劑盒、細(xì)胞間黏附分子（ICAM）-1和β-ACTIN抗體（英國Abcam公司）。

1.3 儀器 BIORAD酶標(biāo)儀（550），BIORAD電流和轉(zhuǎn)膜儀，722分光光度計(jì)算，LEICA石蠟切片機(jī)，NIKON顯微鏡（TE-2000）。

1.4 分組與給藥 將動物隨機(jī)分成5組，即空白對照組，ANIT模型組，退黃合劑低、中、高劑量組，每組12只?？瞻讓φ战M給等容積的生理鹽水，ANIT模型組一次性灌胃 150 mg/kg ANIT［2］。退黃合劑低、中、高劑量組，分別給予退黃合劑每日 5、15、30 g/kg，灌胃 3 d，最后1次給藥后30min一次性灌服150 mg/kg ANIT。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 大鼠在ANIT灌胃48 h后處死，分別取血清和肝組織用于指標(biāo)分析。取大鼠血液，離心（3000 r/min，10min）后取血清，按試劑盒說明書分別檢測血清中 ALT、AST、ALP、DBIL 和 TBIL。取部分肝臟組織，4%多聚甲醛固定后梯度酒精脫水后石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡200倍下觀察肝組織形態(tài)變化。取肝組織200 mg用加入蛋白酶抑制劑的組織裂解液提取總蛋白，并測定總蛋白濃度。隨后按ELISA試劑盒說明書測定肝組織中MIP-2含量，以每毫克總蛋白標(biāo)準(zhǔn)化。用上述提取總蛋白按試劑盒說明書檢測SOD活性。另取大鼠肝組織200 mg提取總蛋白，然后檢測肝組織內(nèi)MPO的活性，并計(jì)算每克肝組織中MPO的活性。免疫組織化學(xué)法檢測ICAM-1表達(dá)，取100 mg肝組織研磨后裂解組織、提取蛋白，BCA法蛋白定量。取40 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫下封閉1 h；加入一抗4℃冰箱孵育過夜；脫洗3次，二抗孵育1 h，再脫洗5次后，ECL顯色，X光片曝光，洗片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較應(yīng)用 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清轉(zhuǎn)氨酶、ALP和膽紅素水平比較 見表1。與空白對照組相比，ANIT模型組血清中ALT、AST和ALP酶的活性明顯增高，同時(shí)血清中DBIL、TBIL也顯著增加（P＜0.01）；而相對于ANIT模型組，退黃合劑低、中、高劑量組血清中ALT、AST和ALP活性盡管在低劑量組無顯著差異（P＞0.05），但高、中劑量組顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01）。而 ALP、DBIL、TBIL 退黃合劑各劑量組均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量低賴性降低。

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、ALP、DBIL和TBIL水平比較（）

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、ALP、DBIL和TBIL水平比較（）

與空白對照組比較，*P＜0.01；與ANIT模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

2.2 各組肝臟組織形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見圖1?？瞻讓φ战M，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，膽管區(qū)無明顯異常，但在ANIT模型組的肝臟中，可見炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞變性、壞死，膽管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。退黃合劑可改善ANIT導(dǎo)致的這些病理改變，特別是在高劑量組，可見肝細(xì)胞壞死明顯減少，膽管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰。

圖1 各組肝臟組織形態(tài)學(xué)（200倍）

2.3 各組肝組織中MIP-2、MPO和SOD水平比較 見表2。與空白對照組比較，ANIT模型組肝內(nèi)MIP-2生成和MPO活性顯著增高（P＜0.01），但SOD的活性卻明顯降低（P＜0.01）；相對于ANIT模型組，退黃合劑呈劑量依賴地抑制MIP-2生成和MPO的活性，但卻增高SOD的活性。

表2 各組大鼠肝組織中MPO、SOD活性及MIP-2水平比較（）

表2 各組大鼠肝組織中MPO、SOD活性及MIP-2水平比較（）

2.4 各組肝組織中ICAM-1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見圖2、表3。以內(nèi)參蛋白β-actin的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后，相對于空白對照組，ANIT模型組動物肝組織中ICAM-1的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01），然而這種上調(diào)ICAM-1可被退黃合劑呈劑量依賴地下調(diào)。

圖2 各組肝組織中ICAM-1表達(dá)水平

表3 各組大鼠肝組織中ICAM-1表達(dá)量（）

表3 各組大鼠肝組織中ICAM-1表達(dá)量（）

與 ANIT模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，△P＜0.01。

3 討 論

ANIT是一種肝毒性物質(zhì)，主要影響膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷，表現(xiàn)為血液中膽紅素和轉(zhuǎn)氨酶的顯著增高［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，退黃合劑可呈劑量依賴性地改善ANIT誘導(dǎo)的這種肝損傷，包括減少轉(zhuǎn)氨酶和ALP的活性，降低血清中DBIL和TBIL的含量，減輕肝臟的病理性改變。因此，退黃合劑對ANIT致膽汁淤積性肝炎有保護(hù)作用。

先前的研究表明，中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在ANIT致膽汁淤積性肝炎發(fā)病中扮演著重要的作用［3］。ANIT損傷膽管細(xì)胞和肝細(xì)胞，釋放一系列介質(zhì)，通過募集大量的中性粒細(xì)胞，產(chǎn)生活性氧，引起肝臟的炎癥反應(yīng)，加重膽汁淤積和肝臟的壞死。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)ANIT處理的大鼠肝臟中MPO活性顯著增高，而退黃合劑劑量依賴地抑制MPO的活性。由于MPO是中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)志分子，因此，這一結(jié)果提示，退黃合劑能有效地減輕肝臟中性粒細(xì)胞的浸潤。另外，浸潤的中性粒細(xì)胞通過NADPH氧化酶生成大量活性氧，氧化肝臟中的還原酶如SOD等，阻斷這些還原酶的活性?；诖耍P者也分析肝臟中SOD活性，其結(jié)果也顯示，退黃合劑明顯改善ANIT抑制的SOD活性。MIP-2被認(rèn)為是促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤的最主要趨化因子，可通過和中性粒細(xì)胞上的CXCR2受體結(jié)合，吸引中性粒細(xì)胞的募集。Xu等［4］在研究中發(fā)現(xiàn)，ANIT致肝內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤，是通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞釋放MIP-2實(shí)現(xiàn)的，CXCR2敲除的肝臟內(nèi)中性粒細(xì)胞明顯減少，且ANIT誘導(dǎo)的肝損傷也顯著減輕。通過酶聯(lián)免疫法進(jìn)一步檢測肝組織內(nèi)MIP-2的含量，筆者發(fā)現(xiàn)：相似于MPO的結(jié)果，退黃合劑也呈劑量依賴性地抑制ANIT誘導(dǎo)的肝內(nèi)MIP-2的生成。事實(shí)上，在炎癥細(xì)胞浸潤過程中，除了趨化因子，也涉及到一些黏附分子。ICAM-1是一個(gè)重要的黏附分子，能介導(dǎo)重要的炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等的浸潤，ICAM-1和Mac-1參與肝臟內(nèi)中性粒細(xì)胞的募集和活化［5］。通過免疫印跡法筆者也發(fā)現(xiàn)退黃合劑能抑制ANIT上調(diào)的ICAM-1的表達(dá)。

總之，通過本研究可以發(fā)現(xiàn)，退黃合劑是一種有效的肝臟保護(hù)和降低黃疸的中藥方劑，其作用機(jī)制可能涉及到通過降低MIP-2的生成和ICAM-1的表達(dá)，從而減輕肝臟中性粒細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)。

［1］魏日胞，霍海如，周愛香.退黃合劑主要藥效學(xué)研究［J］.中藥藥理與臨床，2001，17（2）：33-34.

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［3］Hill DA，Jean PA，Roth RA.Bile duct epithelial cells exposed to alpha-naphthylisothiocyanate produce a factorthat causes neutrophil-dependenthepatocellularinjuryinvitro ［J］.Toxicol Sci，1999，47（1）：118-125.

［4］Xu J，Lee G，Wang H，et al.Limited role for CXC chemokines in the pathogenesis of alpha-naphthylisothiocyanate-induced liver injury［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2004，287（3）：G734-741.

［5］Luyendyk JP，F(xiàn)lanagan KC，Williams CD，et al.Tissue factor contributes to neutrophil CD11b expression in alphanaphthylisothiocyanate-treated mice［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2011，250（3）：256-262.