尿液蛋白質(zhì)組學(xué)中樣品前期處理方法的研究進(jìn)展

盧海濤，牛超，倪茂巍，朱忠欣，叢維濤，金利泰

尿液是血液經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)，腎小管和集合管重吸收、排瀉及分泌產(chǎn)生的終末代謝產(chǎn)物，其組成與性狀可反映整個(gè)泌尿系統(tǒng)的狀況。尤其是尿液中蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的變化攜帶有泌尿系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的各種信息，而尿液蛋白質(zhì)組學(xué)是詮釋尿液蛋白所攜帶信息的最有效方法之一，而且此研究可以發(fā)現(xiàn)體內(nèi)很多疾病的生物標(biāo)志，例如膀胱癌和腎炎等。然而尿液中的鹽濃度高，代謝廢物多，還有很多低濃度的復(fù)合物，復(fù)雜的組成成分大大增加了尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究難度[1]。因此，尿液樣品的前期處理在尿液蛋白質(zhì)組學(xué)分析和疾病分析過(guò)程中是一個(gè)相當(dāng)重要的環(huán)節(jié)。本文著重闡述近年來(lái)國(guó)內(nèi)外尿液蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的前期處理方法以及各方法的比較。

常用的尿液樣品前期處理技術(shù)主要包括兩種：非濃縮型與濃縮型尿液樣品處理。用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法、Folin 法及凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)這兩種方法處理的尿液樣品，并且利用臨床上的腎活檢符合率指標(biāo)來(lái)檢驗(yàn)其準(zhǔn)確度。其中非濃縮尿液樣品腎活檢符合率約 90.0%；濃縮型尿液樣品腎活檢符合率約 99.0%。

1 非濃縮型尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的樣品處理

尿蛋白成分可用于反映腎小球及腎小管損傷的程度。從近幾年研究來(lái)看，臨床檢驗(yàn)主要運(yùn)用腎組織穿刺活檢和非濃縮型處理尿液后蛋白檢測(cè)兩種技術(shù)。腎組織穿刺活檢雖是準(zhǔn)確判斷腎臟病變的方法，但其創(chuàng)傷性和高風(fēng)險(xiǎn)性限制了其應(yīng)用，不易被患者接受。而非濃縮型處理尿液后蛋白檢測(cè)方法因其對(duì)患者身體無(wú)任何損傷、取材方便、報(bào)告快速準(zhǔn)確，而且比較全面、客觀反映尿中蛋白質(zhì)的整體情況等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，其方法步驟主要是非濃縮處理尿液后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。姜儻[2]用此方法檢測(cè)腎炎患者尿液，用磺柳酸作蛋白定性，生理鹽水予以稀釋后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和十二烷基硫酸鈉-瓊脂糖凝膠電泳（SDS-AGE），將尿液中的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)作用下按照分子量大小進(jìn)行分離。分子量 < 70 kD 為腎小管性蛋白尿，主要用來(lái)反映腎小管重吸收功能障礙；分子量 = 70 kD 為選擇性腎小球性蛋白尿；分子質(zhì)量 > 70 kD 為非選擇性腎小球性蛋白尿，主要用來(lái)反映腎小球?yàn)V過(guò)功能障礙。文獻(xiàn)[1]報(bào)道，腎組織活檢與 SDS-AGE 尿蛋白電泳技術(shù)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，其符合率高達(dá) 94.4%。

2 濃縮型尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的樣品處理

按照濃縮法處理尿液后的效果可以分為低濃縮型與高濃縮型兩種方法[3]，這兩種方法各有其特點(diǎn)（表1）。低濃縮型方法是指對(duì)尿樣進(jìn)行相對(duì)較低程度的處理或經(jīng)過(guò)低濃縮程度設(shè)備的過(guò)程；高濃縮型則是對(duì)尿樣進(jìn)行相當(dāng)高的濃縮過(guò)程，進(jìn)一步減少尿中微量蛋白的丟失，更加適用于尿樣臨床腎病檢驗(yàn)。這兩種方法具有純化濃縮性能優(yōu)越、準(zhǔn)確性好、操作條件溫和、尿中微量蛋白丟失少和腎活檢符合率高等優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)是操作相對(duì)復(fù)雜，經(jīng)濟(jì)費(fèi)用較高。

表1 高濃縮型與低濃縮型樣品處理方法的比較

2.1 低濃縮型尿液樣品處理

對(duì)尿液樣品進(jìn)行低濃縮型方法處理的目的是運(yùn)用簡(jiǎn)便的操作去除尿液中非蛋白的部分雜質(zhì)，減少后續(xù)處理的負(fù)荷，以利于精制、分析等后續(xù)工序的進(jìn)行，最終減少部分雜質(zhì)的干擾[4]，提高與臨床組織活檢的符合率。這類型的尿液蛋白處理方法各有其特點(diǎn)（表 2）。

表2 低濃縮型尿液樣品處理方法的比較

2.1.1 物理法濃縮 物理法濃縮就是利用溫度、壓強(qiáng)、分子大小等物理性質(zhì)對(duì)尿樣進(jìn)行前期濃縮處理。易菲等[5]對(duì)尿液樣品在低溫加壓超濾系統(tǒng)中濃縮尿微量蛋白質(zhì)。磁力攪拌（200 r/min），在 N2高壓（40000 kg/m2）下使尿液通過(guò)濾膜濃縮尿液微量蛋白。在 5 mol/L Tris-緩沖液下透析過(guò)夜去鹽，再次濃縮后收集，檢出限可達(dá) 10 μg。

這類方法操作簡(jiǎn)單、對(duì)蛋白活性影響小，對(duì)后續(xù)操作影響低，但是濃縮尿液效果不佳，準(zhǔn)確度較低。

2.1.2 化學(xué)法濃縮 化學(xué)法濃縮則是利用外加化學(xué)試劑來(lái)處理尿樣。Thongboonkerd 等[6]進(jìn)行的有機(jī)溶劑沉淀法是常用的尿液蛋白富集濃縮方法。從防腐劑（異噻唑啉酮）、尿液解凍溫度（37 ℃）、丙酮沉淀時(shí)間（過(guò)夜）和尿液與丙酮體積比（1∶3）等 4 個(gè)方面考察，綜合探尋丙酮沉淀法富集蛋白的最佳方法，更好地優(yōu)化丙酮濃縮尿液樣品的方法，檢出限可達(dá) 5 μg。Sarote 等[7]利用 80% PEG 及 15%(NH4)2SO4組成的雙水相體系，從尿液中萃取出尿蛋白。研究了 (NH4)2SO4飽和度、鹽析次數(shù)、分級(jí)鹽析對(duì)尿蛋白提取率和濃縮度的影響，結(jié)果表明，尿蛋白的濃縮度隨(NH4)2SO4飽和度的提高而增加，飽和度為 45% 時(shí)濃縮度最高，達(dá)到 97.98%。該作者還做了 (NH4)2SO4兩次鹽析，尿液濃縮度提高。二步法鹽析尿蛋白的濃縮度是一步法鹽析的 122.42%，尿蛋白鹽析條件的優(yōu)化為下游尿蛋白質(zhì)組學(xué)的操作奠定基礎(chǔ)，檢出限可達(dá) 1 μg。

化學(xué)法濃縮尿液樣品處理方法的優(yōu)點(diǎn)為靈敏度比物理法濃縮型高，操作較為簡(jiǎn)便，但是效果仍不太理想，對(duì)蛋白活性影響大，容易丟失微量蛋白，故仍需對(duì)這類方法進(jìn)行相關(guān)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2 高濃縮尿液樣品處理

高濃縮型尿液樣品處理方法因其具有準(zhǔn)確度高、可信度高、檢出限低、蛋白丟失少和腎活檢符合率高等優(yōu)點(diǎn)廣泛運(yùn)用于尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的前期實(shí)驗(yàn)中，各種方法的特點(diǎn)如表 3所示。一方面濃縮蛋白可保證強(qiáng)的檢測(cè)信號(hào)，另一方面又能去除大部分非蛋白雜質(zhì)。但是因?yàn)閮r(jià)格貴、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，限制該技術(shù)廣泛運(yùn)用于臨床腎病檢驗(yàn)中。

表3 高濃縮型方法的比較[8-10]

2.2.1 固相萃取型濃縮 Al-Musaimi 等[11]采用固相萃取-高效液相色譜的方法對(duì)尿液進(jìn)行濃縮純化，此方法利用萃取劑對(duì)尿液中的蛋白進(jìn)行選擇性吸附，洗脫液富集后以甲醇-乙酸（15∶85，V/V）溶液為流動(dòng)相，C18為固定相，于280 nm 測(cè)定其中的尿蛋白含量。該方法結(jié)果表明：尿蛋白在 2.26～145 mg/L 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為 0.45 mg/L，方法的平均加權(quán)回收率大于 90%，RSD 小于 4.2%。采用該方法對(duì) 80 名健康人尿樣進(jìn)行了前期蛋白處理，并進(jìn)行蛋白檢測(cè)，結(jié)果為 1.55～6.79 mg/L。后來(lái)，Nagaraj 和 Mann[12]利用固相萃取處理尿液樣品并進(jìn)行LC-MS/MS 分析處理泌尿道炎癥患者的尿液。其有 4 個(gè)主要步驟：提取患者晨尿中段、胰蛋白酶消化、SPE 小管純化蛋白質(zhì)以及 LC-MS/MS 分析，成功檢測(cè)出 TNF、ILs、IFN 等因子，并且檢出極其微量的 B 因子。但是該方法對(duì)尿液蛋白質(zhì)具有選擇性吸附，難免會(huì)有微量蛋白丟失，并且洗脫分離的時(shí)間不容易把握。

2.2.2 親和層析型濃縮 親和層析是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物，使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的方法。它具有很高的選擇和分離性能以及較大的載量，可以使待分離的尿液蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來(lái)，并保持較高的活性。Malinowska 等[13]報(bào)道，對(duì)體內(nèi)各種蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，其中具有關(guān)于尿液樣品蛋白質(zhì)檢測(cè)的描述。實(shí)驗(yàn)員選取正常尿液、腎病患者的發(fā)病期與治療期的尿液進(jìn)行檢測(cè)蛋白質(zhì)的種類與含量。其中，對(duì)尿液樣品同位素標(biāo)記尿液蛋白質(zhì)后進(jìn)行 HiTrapr Protein AFF 親和層析柱純化的前期處理，然后采集一部分進(jìn)行免疫沉淀，另一部分進(jìn)行 MS/MS 測(cè)定尿液中蛋白質(zhì)的相對(duì)和絕對(duì)含量。這種實(shí)驗(yàn)室處理尿液樣品的方法十分準(zhǔn)確地檢測(cè)出腎病患者的蛋白種類與含量，指導(dǎo)臨床的診治。但是要處理體積較大的尿液樣品，親和柱層析的效率較低，需要進(jìn)行相關(guān)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。后來(lái)發(fā)展了親和超濾法，既保持了尿液蛋白與固定相的親和性，又對(duì)尿液樣品進(jìn)行超濾法處理，這種方法提高了對(duì)尿液蛋白質(zhì)的濃縮度與濃縮效率。Tekea 和 Telefoncub[14]用親和超濾技術(shù)濃縮尿液樣品，并提取分離尿液中牛胰磷脂酶A2(PLA2)。這種方法是基于殼聚糖-磷酰乙醇胺的合成樹(shù)脂為親和載體，濃縮處理尿樣后，將前次濃縮的尿樣再次在Ca2+存在條件下進(jìn)行親和超濾，最后以 EDTA 為洗脫劑，結(jié)果顯示該酶被純化 79 倍，活性回收率為 76.3%。

2.2.3 蛋白芯片型濃縮 蛋白芯片是一種高通量監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)靶分子和捕捉分子相互作用來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白分子之間的相互作用。捕獲分子一般都固定在芯片表面，由于配體的高度特異性和與溶液蛋白強(qiáng)結(jié)合特性所以被廣泛地用作捕獲分子。Alkhalaf 等[15]采用的蛋白質(zhì)芯片-質(zhì)譜聯(lián)用（SELDI-TOF-MS）技術(shù)是基于蛋白質(zhì)芯片與尿液蛋白結(jié)合牢固的原理進(jìn)行的。將尿液樣品上樣到芯片表面，孵育后，送入 TOF-MS 檢測(cè)。分離到 195 個(gè)斑點(diǎn)，而用固相配體處理后的樣品則分離到 487 個(gè)清晰的斑點(diǎn)，極大地?cái)U(kuò)大濃縮度，并且減少微量蛋白的丟失，更有可信度。后來(lái)，Per?i等[16]發(fā)展了蛋白質(zhì)微陣列晶片技術(shù)，運(yùn)用了特異性抗原-抗體結(jié)合技術(shù)與尿液蛋白質(zhì)微陣列晶片技術(shù)結(jié)合來(lái)處理并分析慢性腎炎患者尿液，非常準(zhǔn)確地檢測(cè)相關(guān)的腎炎疾病。蛋白質(zhì)微陣列晶片技術(shù)是一項(xiàng)與固定在表面的蛋白配體或者某些片段（DNA、RNA、protein、antibody 等）相關(guān)的技術(shù)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)這項(xiàng)技術(shù)的不足之處是沒(méi)有簡(jiǎn)單的方法濃縮大體積的尿液，可能在尿液中出現(xiàn)功能性保守的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致下游檢測(cè)靈敏度下降。

2.2.4 免疫磁珠型濃縮 Hall 等[17]運(yùn)用免疫磁珠分離技術(shù)（immuno-magnetic bead-based separation，IMS）處理尿樣來(lái)建立尿液快速免疫學(xué)檢測(cè)和分離濃縮技術(shù)。它是以高均一性的磁性微球?yàn)楣滔噍d體，表面包被有免疫配基，如抗體等。結(jié)果表明前期尿樣處理理想，與尿蛋白的結(jié)合力更強(qiáng)。把磁珠結(jié)合到輔助激光解吸電離基質(zhì) MALDI-matrix（如CHCA）中，濃縮倍數(shù)大大增加。目前該項(xiàng)技術(shù)在尿液蛋白分離及尿液生化檢測(cè)等方面均取得了較大的進(jìn)展。

2.2.5 同位素標(biāo)簽型濃縮（ICAT） Weeks[18]對(duì)尿液中蛋白質(zhì)進(jìn)行二向差異凝膠電泳（2D-DIGE）分離純化蛋白質(zhì)，篩選出癌癥疾病代謝的相關(guān)尿液蛋白質(zhì)之后進(jìn)行質(zhì)譜分析，準(zhǔn)確檢測(cè)出主要的 26 種癌癥相關(guān)蛋白質(zhì)。2D-DIGE 方法能夠使尿液中的蛋白質(zhì)經(jīng)花青素標(biāo)記其 N 端區(qū)域后可以對(duì)多個(gè)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行同步化檢測(cè)和差異分析。這種方法實(shí)現(xiàn)了在蛋白質(zhì)分子水平上對(duì)癌癥進(jìn)行實(shí)時(shí)的臨床診治和臨床護(hù)理。有兩組實(shí)驗(yàn)室先后對(duì)腎病患者尿液蛋白質(zhì)檢測(cè)過(guò)程中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的問(wèn)題提出“穩(wěn)定同位素標(biāo)記多肽標(biāo)準(zhǔn)物（stable-isotope-labeled peptide standards，SIS）”的實(shí)驗(yàn)方案，在液相層析聯(lián)用質(zhì)譜處理腎病患者尿液樣品的過(guò)程中添加氨基酸 C 端同位素標(biāo)記物 [13C6,15N2]-Lys（98%）或者[13C6,15N4]-Arg（98%）[19-20]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，這種實(shí)驗(yàn)方案避免尿液中的常量與微量蛋白質(zhì)的降解，更加全面準(zhǔn)確地分析腎病患者代謝的蛋白質(zhì)種類與含量的情況，進(jìn)而準(zhǔn)確地探究患者患病情況。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)尿液

利用尿液蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)泌尿道疾病的蛋白質(zhì)可以探究疾病的病理機(jī)制。通過(guò)采集正常尿液（作為對(duì)照）和各種泌尿道疾病患者的尿液進(jìn)行蛋白質(zhì)組的方法處理與分析，獲得尿液中蛋白質(zhì)種類與含量等信息，建立尿液蛋白質(zhì)圖譜，并且結(jié)合臨床上泌尿道疾病的相關(guān)信息，探究疾病的病理機(jī)制。

3.1 正常尿液蛋白質(zhì)圖譜

Liu 等[21]對(duì) 20 名正常志愿者（10 男、10 女）的晨尿通過(guò)液相層析純化處理后聯(lián)用 MS/MS 分析，檢測(cè)到少于5% 的新生多肽或蛋白質(zhì)，并且檢測(cè)到男性與女性尿中蛋白質(zhì)含量差異。另外，也運(yùn)用 Western blot 的技術(shù)檢測(cè)男性與女性尿液蛋白質(zhì)種類差異性表達(dá)。通過(guò)各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)的分析與整理，建立了正常尿液蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜。

3.2 腎臟移植

Loftheim 等[22]采用尿液蛋白質(zhì)捕獲的蛋白質(zhì)組學(xué)方法并結(jié)合質(zhì)譜儀分析手段，對(duì)數(shù)十名患者腎臟移植發(fā)生的急性排斥反應(yīng)的尿液代謝物進(jìn)行處理、檢測(cè)與分析，從而檢測(cè)出急性排斥反應(yīng)中的蛋白質(zhì)種類，包括類生長(zhǎng)因子蛋白質(zhì)、免疫應(yīng)答因子等，從而確診出疾病類型。其方法的疾病符合率高于臨床上腎活體檢測(cè)的診斷。既證實(shí)尿液蛋白質(zhì)可以很好地作為疾病標(biāo)簽分子，也證實(shí)尿液樣品的前期處理、檢測(cè)分析等尿液蛋白質(zhì)組學(xué)方法非常有利于與尿液相關(guān)疾病的臨床診治。

3.3 常染色顯性多囊性腎病

常染色顯性多囊性腎病（ADPKD）的患病率占晚期腎炎疾病的 10%。尿液蛋白質(zhì)組學(xué)在 ADPKD患者中的尿液標(biāo)簽蛋白分子的檢測(cè)具有準(zhǔn)確率高的良好優(yōu)勢(shì)。運(yùn)用尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的低分子量指紋圖譜方法檢測(cè) ADPKD 患者尿液蛋白質(zhì)的含量和蛋白質(zhì)足跡方法分析 ADPKD 患者尿液蛋白質(zhì)大分子片段。Bakun 等[23]利用尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究30 名 ADPKD 患者的尿液，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 1400 多個(gè)蛋白質(zhì)，繼而通過(guò)蛋白足跡分析，確定了 155 個(gè)與 ADPKD 患者顯著性相關(guān)的蛋白質(zhì)。接下來(lái)與體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)聯(lián)合分析，確定載脂蛋白、絲氨酸蛋白酶抑制劑、幾種生長(zhǎng)因子、膠原以及胞外基質(zhì)補(bǔ)體系統(tǒng)等參與 ADPKD 疾病的形成。

3.4 泌尿道腫瘤

Chen 等[24]利用液相色譜純化后聯(lián)用質(zhì)譜分析二甲基同位素標(biāo)簽的泌尿道腫瘤的終尿蛋白質(zhì)，檢測(cè)出 24 種微量腫瘤相關(guān)蛋白，如胰島素樣生長(zhǎng)因子 II mRNA 結(jié)合蛋白（IMP3，一種癌胚蛋白）的含量升高，染色質(zhì)重塑因子腫瘤相關(guān)鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子 2（TACSTD2）的含量大大增加，以及 ARID1A（一種腎小球癌的抑制蛋白）的含量降低等情況。實(shí)驗(yàn)員建立了臨床確診的泌尿道腫瘤與其尿液蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的圖譜，并建立某些疾病的致病信號(hào)通路。然后，利用已建立的圖譜所提供的信息，建立多反應(yīng)機(jī)制來(lái)觀測(cè)患者尿液中蛋白質(zhì)的變化進(jìn)而關(guān)注治療藥物的代謝情況。

3.5 非侵襲性腎炎

Torres 等[25]通過(guò)藥物托伐普坦（選擇性抗利尿激素 2的拮抗藥物）治療非侵襲性腎炎的機(jī)制與尿液蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)尿中蛋白質(zhì)的方法的結(jié)合來(lái)研究非侵襲性腎炎的病理機(jī)制。通過(guò)對(duì)尿液樣品進(jìn)行六勝肽處理重塑尿液蛋白質(zhì)后經(jīng)抗體親和柱純化蛋白，然后同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)，最后利用MS/MS 聯(lián)用測(cè)定蛋白質(zhì)種類和含量。在多名非侵襲性腎炎患者中檢驗(yàn)出 7 種載脂蛋白以及 TIM、SAA4和 proEGF等 111 種蛋白。進(jìn)一步驗(yàn)證獲悉，載脂蛋白與 TIM 共同誘發(fā)非侵襲腎炎癥的發(fā)生，而 SAA4和 proEGF 使炎癥加劇，甚至誘發(fā)泌尿道癌癥的發(fā)生。這整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程充分地證實(shí)了尿液蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)腎病的病理分析和臨床診治提供重要的信息，并有助于建立臨床預(yù)防與診治的方案。

4 結(jié)語(yǔ)

尿液蛋白，尤其是低豐度尿液蛋白是良好的生物標(biāo)志物來(lái)源，在疾病的診斷、監(jiān)測(cè)、預(yù)后等方面很有價(jià)值，有廣闊的應(yīng)用前景[26]。但由于尿液蛋白濃度低和干擾因素多等原因，很多檢測(cè)手段無(wú)法對(duì)尿液中的蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。目前常規(guī)的尿蛋白濃縮法已無(wú)法滿足飛速發(fā)展的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究。尿液蛋白濃縮方法的開(kāi)發(fā)及優(yōu)化將是尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重點(diǎn)之一。

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