抗結(jié)核分枝桿菌RpfB結(jié)構(gòu)域單克隆抗體的制備及鑒定

樊愛琳，馬越云，鄭善鑾，楊麥貴，郝曉柯

第四軍醫(yī)大學(xué) 西京醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710032

結(jié)核病是危害人類健康的重要傳染病，我國的肺結(jié)核患者數(shù)量位居世界第二。結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染人體后，絕大多數(shù)以潛伏感染（休眠菌）的形式存在?，F(xiàn)有的抗結(jié)核藥物可以有效殺死處于生長狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌，但對處在休眠狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌效果甚微。當(dāng)患者的抵抗力低下時，休眠的MTB 就會大量繁殖，重新處于致病狀態(tài)[1-2]。

研究發(fā)現(xiàn)，在MTB 休眠菌的復(fù)蘇過程中，5 種促進(jìn)復(fù)活因子（resuscitation promoting factor，Rpf）發(fā)揮了重要作用，它們分別為RpfA、RpfB、RpfC、RpfD和RpfE[3]，是由MTB分泌的。Rpf最早在藤黃微球菌（Micrococcus luteus）中被發(fā)現(xiàn)[4]，它也是發(fā)現(xiàn)的第一個能夠促使休眠菌恢復(fù)生長繁殖能力的分泌型蛋白，是宿主免疫系統(tǒng)識別的靶抗原，其產(chǎn)生的特異性抗體能阻斷Rpf 蛋白對MTB 休眠菌的復(fù)蘇作用，因此Rpf 蛋白可能是預(yù)防和控制MTB 感染的新途徑。同源性分析發(fā)現(xiàn)，在多種富含G+C 的革蘭陽性細(xì)菌中有Rpf樣蛋白存在，均具有Rpf樣結(jié)構(gòu)域[4]。Rpf蛋白結(jié)構(gòu)域是一個含77 個氨基酸殘基的截斷肽，位于Rpf 蛋白全長的A42～L118。研究發(fā)現(xiàn)Rpf 蛋白結(jié)構(gòu)域具有與Rpf 蛋白一致的生物學(xué)功能，其體外復(fù)活休眠菌的作用與完整的Rpf蛋白相同，也具有Rpf蛋白相似的免疫原性，誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體可能會阻斷MTB的Rpf家族的全部Rpf樣蛋白，抑制細(xì)菌的復(fù)蘇和生長[5]。MTB的5種Rpf樣蛋白功能重疊[6]，實驗表明敲除其中任何一個Rpf 基因時，其生長不會受到明顯影響[7]。這表明MTB 的5 種Rpf 樣蛋白存在協(xié)同作用，共同對MTB 的休眠進(jìn)行控制。因此，如何對其進(jìn)行優(yōu)化組合將成為疫苗研發(fā)及實驗室檢測方法建立的重要障礙。研究表明，RpfB 在MTB 的生長中發(fā)揮較為重要的作用。RpfB 蛋白為膜蛋白，具有多種T 細(xì)胞和B 細(xì)胞抗原表位，突變RpfB 可明顯減緩H37Ra 的生長速度[8]。本實驗室前期的研究也發(fā)現(xiàn)RpfB 具有較強的生物學(xué)和免疫學(xué)特性[9]。因此，RpfB 結(jié)構(gòu)域可能是研究MTB Rpf 蛋白免疫學(xué)特性及生物學(xué)功能的切入點。為此，我們以原核表達(dá)純化的RpfB 結(jié)構(gòu)域多肽作為免疫原，制備其單克隆抗體，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)和免疫學(xué)特性提供了重要工具。

1 材料和方法

1.1 材料

BALB/c 小鼠（雌性，6～8 周齡）由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供；結(jié)核桿菌H37Ra 株為陜西省結(jié)核病防治研究所惠贈；藤黃微球菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸桿菌DH5α為西京醫(yī)院檢驗科細(xì)菌室保存；Sp2/0 細(xì)胞系由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室饋贈；pPRO-EXHTRpfB domain 重組質(zhì)粒為本實驗室制備[10]；PEG、HT及HAT 購自Promega 公司；6×His 單抗、HRP 山羊抗小鼠IgG 抗體購自華美生物公司；Ni2+-NTA 純化試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 結(jié)核分枝桿菌RpfB結(jié)構(gòu)域多肽的表達(dá)和純化

將pPRO-EXHT-RpfB domain 原核表達(dá)載體接種于大腸桿菌DH5，用0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4 h，表達(dá)的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE 及Western 印跡鑒定，采用Ni2+-NTA 純化試劑盒按變性條件進(jìn)行親和色譜純化目的蛋白，采取逐步降低尿素濃度的方法除去尿素，使變性蛋白自然復(fù)性。

1.3 單抗細(xì)胞株的建立

用純化的RpfB 結(jié)構(gòu)域多肽免疫BALB/c 小鼠3次，每次間隔2 周；采用PEG1500 融合劑，將免疫小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0 融合，用含HAT 的培養(yǎng)液培養(yǎng)融合細(xì)胞5 d，之后改用含HT 的培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d 至第8 d，用間接ELISA 法檢測培養(yǎng)上清抗體效價，將陽性孔用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，建立單克隆細(xì)胞株。

1.4 含單抗腹水的制備及純化

將單克隆細(xì)胞株細(xì)胞密度調(diào)至1×109～2×109/L，進(jìn)行小鼠腹腔注射制備腹水，每只小鼠注射0.5 mL，注射后10～15 d可發(fā)現(xiàn)小鼠腹部明顯膨大，抽取腹水，采用正辛酸-硫酸銨法進(jìn)行純化。

1.5 間接夾心ELISA法檢測純化抗體效價

用10 g/L 的RpfB 結(jié)構(gòu)域多肽包被板子，加入系列稀釋的純化抗體，以HRP 標(biāo)記的羊抗鼠為二抗，用OPD 顯色。以Sp2/0 細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對照，免疫小鼠血清作為陽性對照。

1.6 Western印跡鑒定純化單抗的特異性

將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，在37℃用50 g/L 脫脂奶粉封閉1 h，加入純化的單抗，濃度為100 mg/L，孵育1 h，用PBS 洗滌3次，再加入HRP-山羊抗小鼠IgG 抗體，37℃搖床孵育1 h，PBS洗滌3次，加入底物，用OPD顯色。

1.7 ELISA法檢測單抗的特異性

用RpfB結(jié)構(gòu)域多肽和無關(guān)的帶His標(biāo)簽的融合蛋白同時包被板子，以純化的單抗作為一抗，37℃孵育1 h，PBS 洗滌后與1∶1000 稀釋的HRP-山羊抗小鼠IgG抗體37℃反應(yīng)1 h，PBS洗滌，OPD顯色。

1.8 ELISA法鑒定單抗類和亞類

用6 種類和亞類特異性羊抗鼠多克隆抗體檢測不含血清的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，呈陽性反應(yīng)的即可確定型別。

1.9 單抗相對親和力測定

包被RpfB 結(jié)構(gòu)域2 mg/L，4℃過夜，洗滌后用10%小牛血清封閉1 h，加入系列稀釋（200～10-7μg/mL）的純化單抗孵育1 h，PBS洗滌后與1∶1000稀釋的HRP-山羊抗小鼠IgG 反應(yīng)1 h，洗滌后用OPD 顯色，讀取D490nm值并繪制曲線，觀察相對親和力。

1.10 抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的交叉實驗

分別用藤黃微球菌Rpf、Rpf 結(jié)構(gòu)域、MTB RpfB結(jié)構(gòu)域和MTB RpfA、H37Ra 菌株作為抗原包被板子，以制備的單抗（選取效價最高的一株B8G11）作為一抗，用ELISA 法檢測，觀察抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗與Rpf家族蛋白及MTB的交叉反應(yīng)。

1.11 抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的抑制實驗

取休眠狀態(tài)的MTB H37Ra 100 μL 轉(zhuǎn)接到5 mL 7H9培養(yǎng)基中，藤黃微球菌100 μL轉(zhuǎn)接到5 mL葡萄糖肉湯液體培養(yǎng)基中，分別加入不同濃度的RpfB結(jié)構(gòu)域蛋白和抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗，以0.01 mol/L PBS為陰性對照，每個濃度重復(fù)5管，37℃培養(yǎng)，每3 h（27 h 后每6 h）取少量藤黃微球菌培養(yǎng)液測D600nm值，每5 d取少量MTB H37Ra株培養(yǎng)液測D600nm值，繪制各組MTB H37Ra和藤黃微球菌生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 RpfB結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)和純化

原核系統(tǒng)表達(dá)的RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白為不可溶性的，SDS-PAGE 分析表明在Mr約為12×103處有蛋白表達(dá)帶，與目的蛋白大小吻合。在變性條件下純化目的蛋白，收集洗脫液進(jìn)行160 g/L SDS-PAGE 分析，發(fā)現(xiàn)在Mr為12×103處有清晰的條帶，經(jīng)薄層掃描分析融合蛋白純度可達(dá)90%以上（圖1）。

2.2 抗Rpf結(jié)構(gòu)域單抗的制備及鑒定

取小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0 與已免疫小鼠的脾細(xì)胞融合，融合后第8 d用間接ELISA 法檢測，有20孔為陽性，用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，經(jīng)過3 次克隆化得到3 株可穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞系，分別命名為D3A5、B8G11、A9C8，其中D3A5、B8G11 屬IgG1亞類，A9C8 屬IgM 亞類。3 株單抗腹水純化后顯著增高（表1），Western 印跡分析表明該單抗可特異性識別RpfB 結(jié)構(gòu)域多肽（圖2）。ELISA 結(jié)果顯示，帶His 標(biāo)簽的無關(guān)蛋白檢測為陰性，而RpfB 結(jié)構(gòu)域檢測為陽性，說明所獲得的單抗是針對RpfB 結(jié)構(gòu)域的，不是針對His標(biāo)簽的。根據(jù)間接ELISA檢測系列稀釋的單抗與RpfB 結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的D490nm值繪制曲線,以抗原抗體結(jié)合平臺期50%的D490nm值的抗體濃度表示單抗的相對親和力，結(jié)果D3A5、B8G11、A9C8的相對親和力分別為0.1、1和0.05 μg/mL，即A9C8＞D3A5＞B8G11（圖3）。

圖1 結(jié)核分枝桿菌RpfB結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析

表1 D3A5、B8G11、A9C8單抗效價

2.3 抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的交叉實驗

從表2 可以看出，抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗可以與MTB RpfB 結(jié)構(gòu)域、MTB RpfA、藤黃微球菌Rpf、Rpf結(jié)構(gòu)域、H37Ra 菌株發(fā)生反應(yīng)，說明抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗可識別Rpf樣蛋白及其結(jié)構(gòu)域。

2.4 抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗對MTB的生長抑制作用

圖2 純化單抗的Western印跡

圖3 抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的相對親和力

表2 ELISA法檢測抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的交叉實驗

從不同濃度的RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白刺激藤黃微球菌和MTB H37Ra 的生長曲線可以看出，當(dāng)RpfB 結(jié)構(gòu)域濃度為1000 pmol/L 時刺激藤黃微球菌的復(fù)蘇和生長作用明顯，當(dāng)RpfB 結(jié)構(gòu)域濃度為500 pmol/L時刺激MTB H37Ra的復(fù)蘇和生長作用明顯，而且這種刺激作用在加入了1∶1000 的抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗后明顯被抑制（圖4、5）。

3 討論

結(jié)核分枝桿菌感染率很高，多數(shù)感染者并不發(fā)病，是因為MTB 以休眠體狀態(tài)存在于體內(nèi)。Rpf 最先在藤黃微球菌中發(fā)現(xiàn)[5]，它在細(xì)胞外以皮克（10-12g）水平通過自分泌和旁分泌形式發(fā)揮促進(jìn)休眠期細(xì)菌復(fù)活的作用。MTB含有5種Rpf樣蛋白，在功能上有一定的重疊，刪除任何一個編碼Rpf 蛋白的基因都不能明顯影響MTB 的生長，而當(dāng)3 個以上基因被刪除時，MTB 在體外才不能自發(fā)復(fù)蘇[7]。提示單個抗Rpf 抗體并不能完全阻斷所有Rpf 蛋白對結(jié)核菌復(fù)蘇和生長的促進(jìn)作用，只有3個以上抗Rpf抗體聯(lián)合應(yīng)用才能有效阻斷Rpf 蛋白對結(jié)核菌的促復(fù)蘇和生長作用。但如何對其進(jìn)行優(yōu)化組合，成為疫苗研發(fā)及實驗室檢測方法建立的重要障礙。

Vladimir 等的研究表明，藤黃微球菌Rpf 蛋白具有很強的免疫原性，用其免疫C57BL/6 小鼠后，可誘發(fā)T細(xì)胞增殖，引起IL-10、IL-12、γ-干擾素升高，其免疫血清可以抑制MTB H37Ra 的生長與增殖[11]。研究發(fā)現(xiàn)，藤黃微球菌的Rpf蛋白與其Rpf蛋白結(jié)構(gòu)域具有一致的生物學(xué)功能[12]。Rpf 蛋白結(jié)構(gòu)域可能是一種理想的保護(hù)性抗原。

我們利用原核系統(tǒng)表達(dá)獲得了RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白，將純化的蛋白作為免疫原免疫小鼠，制備了3 株單克隆抗體，特異性高，親和力較強，經(jīng)小鼠腹腔注射制備腹水純化后獲得了較高純度的單抗，可識別多種Rpf 樣蛋白及其結(jié)構(gòu)域蛋白。由于Rpf 樣蛋白高度同源、Rpf樣蛋白結(jié)構(gòu)域高度保守[12]，因此，推測抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗可能會識別MTB Rpf 家族的全部Rpf 樣蛋白，這種推測有待于進(jìn)一步驗證。據(jù)此，有可能建立MTB 相關(guān)抗原的檢測方法，可以檢測處于不同感染階段的MTB Rpf 蛋白，這樣不僅可以克服Rpf 蛋白表達(dá)具有時相性難以檢測的缺陷，又達(dá)到了多種抗原聯(lián)合檢測的目的，可以提高M(jìn)TB 檢測的敏感性和特異性。

在觀察RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白對藤黃微球菌和MTB H37Ra 休眠菌促復(fù)蘇和生長作用的同時，我們還觀察了抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗對這種促復(fù)蘇和生長的抑制作用。結(jié)果顯示，抗RpfB 結(jié)構(gòu)域單抗可明顯抑制RpfB 結(jié)構(gòu)域蛋白對MTB H37Ra 和藤黃微球菌休眠菌的復(fù)蘇和生長作用。表明RpfB 蛋白結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)的特異性抗體可能會抑制機體內(nèi)潛伏感染的MTB的再次激活，具有控制隱性感染復(fù)發(fā)的作用。抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗的制備，為進(jìn)一步研究RpfB結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)和免疫特性，評價其是否可作為候選結(jié)核亞單位疫苗的組分提供了實驗工具。

圖4 藤黃微球菌在RpfB結(jié)構(gòu)域蛋白及抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗作用下的生長曲線

圖5 MTB H37Ra在RpfB結(jié)構(gòu)域蛋白及抗RpfB結(jié)構(gòu)域單抗作用下的生長曲線

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