RNA干擾Glut1表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

張秀梅，張 霞，肖建英

(遼寧醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室， 遼寧 錦州 121000)

RNA干擾Glut1表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

張秀梅，張 霞，肖建英*

(遼寧醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室， 遼寧 錦州 121000)

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter proteinl，Glut1)是哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖跨過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞最重要的載體[1]。許多研究證實(shí)不同來(lái)源的惡性腫瘤Glut1表達(dá)水平升高。目前研究表明：Glut1可能與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究探討RNA干擾Glut1表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用，探索腫瘤基因治療的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料:Glut1-siRNA序列：5′-UGAUGUCCAGAAGAAUA GU-3′； control-siRNA序列：5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′，人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，Glut1兔抗人多克隆抗體。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)分為normal組，negative組，Glut1 siRNA 組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染RNA。

1.3 RT-PCR檢測(cè)Glut1 mRNA表達(dá)水平:PCR引物序列如下：Glut1上游引物：5′-CAGTTCGGCTATAACACCGGTGTC-3′，下游引物：5′-GCCAAAGGGATTAACAAAGAGGCC-3′ β-actin上游引物：5′-CCTAGCACCATGAAGATCAA-3′，下游引物：5′-TTTCTGCGCAAGTTAGGTTT-3′。轉(zhuǎn)染48 h后，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用AMV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA,進(jìn)行RT-PCR。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖:將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，分別于細(xì)胞貼壁后第24、48、72和96 h加入MTT 50 μL(1 g/L)，孵育4 h，加入DMSO，振蕩15 min，使沉淀物充分溶解。用自動(dòng)酶標(biāo)分析儀于490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。根據(jù)吸光度值的大小來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算存活率。公式如下：

存活率=加藥組A值/對(duì)照組A值×100%

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期:將MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h消化成單細(xì)胞懸液，75%的乙醇4 ℃固定過(guò)夜，加入DNAStain染色液,室溫避光15 min，上機(jī)測(cè)試。

2 結(jié)果

2.1 RNA干擾后Glut1 mRNA及蛋白表達(dá)水平:與對(duì)照組比較， Glut1干擾組Glut1的mRNA及蛋白水平顯著下降(Plt;0.01)(表1，圖1)。

表1 Glut1 mRNA及蛋白表達(dá)水平Table 1 Glut1 mRNA and protein expression

*Plt;0.01 compared with normal.

1.normal; 2.negative; 3.Glut1 siRNA圖1 Glut1蛋白表達(dá)水平Fig 1 Glut1 protein expression

2.2 細(xì)胞增殖水平分析:結(jié)果顯示，細(xì)胞貼壁后72和96 h，Glut1干擾組的細(xì)胞存活率明顯少于對(duì)照組和陰性對(duì)照組(Plt;0.01，表2)。

表2 Glut1干擾后對(duì)MCF-7細(xì)胞存活率的影響Table 2 Effect of Glut1 on survival rate in MCF-7(±s，n=3)

*Plt;0.01 compared with normal.

2.3 細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果:結(jié)果顯示Glut1干擾組處于G0/G1期的細(xì)胞的比例明顯高于對(duì)照組和陰性對(duì)照組，Glut1干擾組處于S期的細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組和陰性對(duì)照組(Plt;0.01)(圖2)。

3 討論

大量研究表明[2]，腫瘤細(xì)胞表面往往異常高表達(dá)GlutI，以增加葡萄糖的攝取滿(mǎn)足其能量需求，因此認(rèn)為Glut1是細(xì)胞惡變的早期標(biāo)志。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Glut1與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)，Glut1的表達(dá)水平升高可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，滿(mǎn)足腫瘤細(xì)胞對(duì)能量的要求[3]。本研究利用RNA干擾技術(shù)，Glut1干擾組Glut1的mRNA及蛋白水平顯著下降，干擾效率大于50%。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Glut1干擾組的細(xì)胞存活率明顯少于對(duì)照組和陰性對(duì)照組。這可能與RNA干擾后Glut1的mRNA及蛋白水平顯著降低，減少細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取，降低細(xì)胞能量供給，抑制細(xì)胞增殖有關(guān)。

細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Glut1干擾組處于S期的細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組和陰性對(duì)照組， 可能由于Glut1表達(dá)被抑制減少了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，繼而使得細(xì)胞能量供給減少，細(xì)胞停留在能量需要較少的細(xì)胞周期階段，或離開(kāi)細(xì)胞周期，即停止增殖。

綜上所述，Glut1干擾對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖有顯著影響，這為深入理解Glut1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起作用及具體機(jī)制提供新的思路，也為Glut1干擾治療腫瘤提供理論依據(jù)。

[1] Ayala FR, Rocha RM, Carvalho KC,etal.Glut1 and Glut3 as potential prognostic markers for oral squamous cell carcinoma [J].Molecules, 2010,15: 2374-2387.

[2] Frolova A, Flessner L, Chi M,etal. Facilitative glucose transporter type 1 is differentially regulated by progesterone and estrogen in murine and human endometrial stromal cells[J].Endocrinology, 2009,150: 1512-1520.

[3] Kalir T, Wang BY, Goldfischer M,etal. Immunohistochemical staining of GLUT1 in benign, borderline and malignant ovarian epithelia.[J].Cancer,2002,94:1078-1082.

2013-05-30

2013-09-26

遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(LS2010101)

*通信作者(correspondingauthor)： xiaojianying6886@yahoo.com.cn

1001-6325(2014)04-0546-02

R 736.1

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