苦參堿減輕博來霉素致大鼠肺纖維化

曾賽麗，游曉星，張秀峰，何振華*

(南華大學(xué) 1.附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科； 2.病原生物學(xué)研究所, 湖南 衡陽 421001)

苦參堿減輕博來霉素致大鼠肺纖維化

曾賽麗1，游曉星2，張秀峰1，何振華1*

(南華大學(xué) 1.附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科； 2.病原生物學(xué)研究所, 湖南 衡陽 421001)

目的觀察苦參堿對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠的保護(hù)作用，并探討其可能的分子機制。方法大鼠隨機分為對照組、模型組、潑尼松和苦參堿處理組。模型組氣管內(nèi)給予博萊霉素(5 mg/kg) 建立肺纖維化動物模型。建模后第1天起，分別每日予以潑尼松(0.56 mg/kg)和不同劑量的苦參堿(50和100 mg/kg)灌胃1次。于第7、14和28天時，獲取大鼠取肺組織并行HE和Masson染色。檢測肺組織勻漿中丙二醛(MDA)和羥脯氨酸(HYP)含量；RT-PCR法檢測肺組織血紅素氧合酶(HO-1) mRNA的表達(dá)；ELISA檢測TNF-α產(chǎn)生。結(jié)果HE染色顯示，模型組7 d以炎性反應(yīng)為主， 28 d可見大量的肺成纖維細(xì)胞，Masson染色見有更多膠原沉積。而苦參堿與潑尼松能明顯減輕其炎性反應(yīng)和纖維化程度。模型組中MDA和HYP含量較對照組顯著增高(Plt;0.05)，而予以苦參堿及潑尼松干預(yù)以后，二者含量均有下降，以28 d時改變最明顯(Plt;0.05)。在正常肺組織中，HO-1處于低表達(dá)狀態(tài)，TNF-α含量低。而模型組二者的含量明顯上升(Plt;0.01)，苦參堿干預(yù)后，兩者表達(dá)水平顯著降低(Plt;0.05)。結(jié)論苦參堿具有減輕肺纖維化形成的作用，其機制可能與調(diào)節(jié)機體氧化-抗氧化失衡，抑制TNF-α的產(chǎn)生以及下調(diào)HO-1的表達(dá)水平有關(guān)。

苦參堿；血紅素氧合酶-1；腫瘤壞死因子-α；肺纖維化

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一種以肺泡上皮的損傷、炎性細(xì)胞聚集和成纖維細(xì)胞過度增殖為病理特征的彌漫性肺間質(zhì)性疾病[1]。目前其發(fā)病機制尚未明了，但氧化應(yīng)激在炎性反應(yīng)和免疫介導(dǎo)的組織損傷中起了重要作用。氧自由基不僅可直接損傷細(xì)胞和組織，而且能調(diào)節(jié)一系列炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放[2-3]。其中一些炎性細(xì)胞因子又可誘導(dǎo)內(nèi)源性氧自由基的產(chǎn)生，進(jìn)一步促進(jìn)了氧化-抗氧化失衡生，形成惡性循環(huán)。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是一種應(yīng)激蛋白，是機體最重要的內(nèi)源性保護(hù)體系之一，但HO-1的過度表達(dá)也可能是參與肺纖維化的重要因素[4-5]。

目前肺纖維化治療推薦糖皮質(zhì)激素和硫唑嘌呤或環(huán)磷酰胺聯(lián)合治療方案[6]。近年來苦參堿(Matrine)在抗纖維化中的作用已經(jīng)得到了廣泛的研究，但對肺纖維化是否也具有拮抗作用，目前仍不清楚[7-8]。本研究擬通過博萊霉素誘導(dǎo)建立的大鼠肺纖維化模型，探索苦參堿對博來霉素致大鼠肺纖維化的影響，并觀察苦參堿是否可以通過下調(diào)HO-1和TNF-α發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

SPF級雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量180～200 g，(南華大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：2009A023)。食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，實驗期間大鼠均自由飲水?？鄥A粉針劑(純度98%，吉林玉皇藥業(yè)有限公司，批號081123)，醋酸潑尼松片(天津太平洋制藥有限公司生產(chǎn)，批號080201)，注射用鹽酸博來霉素(日本化藥株式會社生產(chǎn)，批號740104)。Trizol試劑(Invitrogen公司)，Quant一步法 RT-PCR試劑盒(Tiangen)。兔抗鼠HO-1多克隆抗體、HPR標(biāo)記羊抗兔多克隆抗體(Santa Cruz公司)。丙二醛和羥脯氨酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。TNF-α ELISA試劑盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)。

1.2 實驗分組與處理

將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、潑尼松處理組和苦參堿干預(yù)組(每組18只)。用腹腔注射10%水合氯醛麻醉(2.5 mL/kg)，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙緩慢注入0.3 mL博萊霉素溶液(5 mg/kg)?？鄥A組每天以50和100 mg/kg苦參堿溶液灌胃1次，潑尼松組每天以5 mg/kg潑尼松灌胃1次，正常對照組和模型組以等量0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.3 肺組織病理組織學(xué)檢查

肺組織用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋。常規(guī)脫水，透明，封片。Masson染色根據(jù)試劑盒提供的步驟進(jìn)行操作，主要包括切片脫蠟處理、Masson復(fù)合染色，最后脫水，透明，封固。

1.4丙二醛(malondialdehyde，MDA)和羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)測定

取0.1 g肺組織解凍后，勻漿，按南京建成生物工程研究所提供的丙二醛、羥脯氨酸測定試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用可見光分光光度計測得各管吸光度值，按照說明書上公式計算肺組織丙二醛和羥脯氨酸含量，單位分別為nmol/mg·protein和μg/mg·protein。

1.5 RT-PCR檢測HO-1 mRNA的表達(dá)

采用Trizol法提取肺組織總RNA。設(shè)計HO-1特異性引物：正向：5′-TGATAGAAGAGGCCAAGACT GCGTT-3′；反向：5′-TGAGTGTAAGGACCCATCGGA GAAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物228 bp。內(nèi)參β-actin正向引物：5′-CCTAAGGCCAACCGTGAA-3′，反相引物：5′-CTAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3′，產(chǎn)物635 bp。擴(kuò)增條件：94 ℃變性2 min；隨后94 ℃ 30 s，57 ℃退火30 s；65 ℃延伸1 min；共35個循環(huán)；最終延伸10 min。以目的基因/內(nèi)參的吸光度比值表示。

1.6 ELISA檢測TNF-α 產(chǎn)生水平

取肺組織后，加入一定量的PBS(pH 7.4)，用手工勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。3 000r/min離心20 min，收集上清。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理變化

HE染色結(jié)果顯示，空白對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰。模型組28d時肺泡結(jié)構(gòu)破壞或消失，肺泡間隔明顯增寬，肺泡結(jié)構(gòu)受壓萎縮，肺泡腔變窄。而苦參堿組(100 mg/kg)和潑尼松組病理變化程度都輕于模型組。Massosn染色結(jié)果顯示，肺組織內(nèi)可見大量膠原纖維沉積，融合成片?？鄥A組及潑尼松組相應(yīng)時間點肺纖維化程度均低于模型組(圖1)。

2.2苦參堿對肺纖維化大鼠肺組織中MDA和HYP的影響

與空白對照組相比，模型組MDA水平最高(Plt;0.05)。潑尼松和不同濃度苦參堿處理后，MDA含量明顯降低(Plt;0.05)。與空白對照組比較，各模型組大鼠肺組織中HYP含量均升高(Plt;0.05)，100 mg/kg苦參堿處理后， HYP含量顯著降低(Plt;0.05)(表1)。

A.HE staining； B.Masson staining圖1 28 d時各組肺組織病理學(xué)改變Fig 1 Pathologic change in the lung tissue at 28 days(×100)

表1 各組MDA和HYP的含量Table 1 MDA and HYP concentration in the four groups(±s,n=3)

*Plt;0.05 compared with control；#Plt;0.05 compared with model.

2.3苦參堿對肺纖維化大鼠肺組織中HO-1mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組相比，模型組大鼠肺組織中HO-1 mRNA的表達(dá)明顯增加。藥物干預(yù)后，苦參堿低劑量組、苦參堿中劑量組及潑尼松組與模型組相比，其HO-1 mRNA表達(dá)均相對降低(Plt;0.05)，尤以7 d時苦參堿中劑量組及潑尼松組明顯(圖2)。

1.marker；2.control；3.model；4.prednisone；5.matrine(100 mg/kg)；6.matrine(50 mg/kg)圖2 第7天各處理組HO-1 mRNA表達(dá)情況Fig 2 HO-1 mRNA expression in groups at 7days

表2 7 d HO-1 mRNA灰度掃描比值Table 2 Expression of HO-1 mRNA(±s,n=3)

*Plt;0.05 compared with control；#Plt;0.05 compared with model.

2.4苦參堿對肺纖維化大鼠肺組織中TNF-α表達(dá)的影響

與空白對照組相比，模型組大鼠肺組織中TNF-α的表達(dá)明顯升高,7 d時為最高峰，后呈逐漸下降；予以藥物干預(yù)以后，與模型組比較，苦參堿低劑量組、苦參堿中劑量組及潑尼松組TNF-α表達(dá)均降低(Plt;0.05)，尤以苦參堿中劑量組及潑尼松組降低明顯(Plt;0.01)(圖3)。

*Plt;0.05 compared with control; #Plt;0.05 compared with model圖3 不同處理組TNF-α水平變化Fig 3 TNF-α concentration in different groups

3 討論

苦參堿來源于豆科植物苦參、苦豆子及廣豆根中，特別是在抗組織纖維化治療方面的作用，受到極大的關(guān)注。氧化應(yīng)激是肺纖維化的重要發(fā)病機制之一。氧自由基能夠攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化。MDA是其產(chǎn)物之一，因而MDA含量變化可以反應(yīng)機體組織細(xì)胞氧化損傷程度。HYP是機體膠原蛋白的主要成分之一，為膠原蛋白所特有，可作為衡量膠原組織代謝的重要指標(biāo)。本實驗發(fā)現(xiàn)，MDA、HYP含量與對照組相比，模型組明顯升高。予以苦參堿及潑尼松干預(yù)后，MDA的含量有下降，HYP含量下降，病理學(xué)檢查提示肺組織的肺纖維化程度減輕。說明苦參堿能減輕博來霉素導(dǎo)致肺組織脂質(zhì)過氧化損傷，具有抗氧化作用，能調(diào)節(jié)機體氧化抗氧化平衡，具有抗纖維化形成的作用。HO-1是內(nèi)源性的抗氧化劑，機體存在氧化損傷時，HO-1就會增加。本研究也發(fā)現(xiàn)HO-1在對空白照組表達(dá)呈低水平狀態(tài)，予以博來霉素建模后，肺內(nèi)的HO-1表達(dá)增加，提示氧化損傷參與肺纖維化。但是在使用苦參堿干預(yù)后，MDA和HO-1水平有所下降。這可能是由于苦參堿本身具有抗氧化能力，可以增加機體抗氧化水平，調(diào)節(jié)氧化抗氧化失衡，能協(xié)同抗氧化酶HO-1共同發(fā)揮抗氧化損傷作用。

近年來，關(guān)于TNF-α在肺纖維化中的作用倍受關(guān)注[9]。本實驗結(jié)果表明： TNF-α在模型組中7 d時處于高峰，隨后逐漸下降，而肺組織7 d可以看見肺泡性反應(yīng)與肺纖維化開始形成共同存在?？鄥A可能通過抑制TNF-α表達(dá)，抑制早期炎性反應(yīng)，從而進(jìn)一步減輕對其他致纖維化細(xì)胞因子的激活，而減輕肺纖維化。其機制可能是在肺纖維化早期通過介導(dǎo)肺泡炎性反應(yīng)和肺損傷發(fā)揮作用，可以直接或間接激活其他致纖維化細(xì)胞因子[10]。

在博來霉素致肺纖維化的過程中，氧化損傷可能啟動前炎性反應(yīng)，炎性反應(yīng)再導(dǎo)致組織氧化損傷。如何在二者中找到一個平衡點，對于尋找抗肺纖維化新的治療方法具有重要的意義。苦參堿作為一種中藥，能夠調(diào)節(jié)機體氧-化抗氧化失衡，以雙重作用抗肺纖維化，且不良反應(yīng)小，具有良好的應(yīng)用前景。

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Matrine alleviates blemycin-induced pulmonary fibrosis in rats

ZENG Sai-li1, YOU Xiao-xing2, ZHANG Xiu-feng1, HE Zhen-hua1*

(1.Dept. of Respiratory Medicine, the Second Affiliated Hospital of University of South China;2.Institution of Pathogenic Biology, University of South China, Hengyang 421001, China)

ObjectiveTo discuss the molecular mechanism and protective effect of matrine on blemycin-induced pulmonary fibrosis rat.MethodsRats were randomly divided into five groups, the control group, model group, prednisone, matrine low dose and high dose group.Pulmonary fibrosis model was made by adminstrated blecomin (5 mg/kg) through trachea. From 1st day after modeling, the rats were fed prednisone acetate (0.56 mg/kg/d) or different dose matrine (50 and 100 mg/kg/d). At the 7, 14, 28 days of modeling, the lung tissue biopsy sections are observed by HE and Masson staining pathology. The malondialdehyde (MDA) level and hydroxyproline (HYP) content in lung tissue was detected,HO-1 mRNA was measured by RT-PCR, and by production of TNF-α. The lung tissue biopsy sections are detected by HE and Masson staining pathology.ResultsIn model group, in-flammatory response was the main event at 7 d. At 28 d, more lung fibroblast were found. The collagen was found more clearly. Pathological change in the matrine and prednisone treated group was less than that from model group. The MDA and HYP content in model group was higher as compared with normal control group (Plt;0.05), and decreased after matrine and prednisone treatment in 28 d (Plt;0.05). In the normal lung tissue, expression of HO-1 and production of TNF-α was very low, and increased in the model group. After drug intervention, the level of both TNF-α and HO-1 was decreased (Plt;0.05).ConclusionsMatrine can alleviate the fibrosis status in rats, and the mechanism may be associated to regulate oxidative-antioxidant imbalance and inhibition of TNF-α and HO-1 expression.

matrine; heme oxygenase-1; tumor necrosis factor-α; pulmonary fibrosis

2013-06-27

2013-11-04

湖南省科研條件創(chuàng)新專項(2010TT2022)；湖南省衛(wèi)生廳科研計劃(B2009058)；衡陽市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃(2009KJ42)

*通信作者(correspondingauthor)： Hezhenhua0734@163.com

1001-6325(2014)04-0504-05

研究論文

R 563.9

A