自體及健康人CIK細(xì)胞治療臨床惡性腫瘤的比較

李 壯，董晨輝，徐 祥，何 靜，黃 宏，郭 韡，邢 偉，王愛民*

(第三軍醫(yī)大學(xué) 第三附屬醫(yī)院 野戰(zhàn)外科研究所 1.關(guān)節(jié)四肢外科； 2.干細(xì)胞移植amp;細(xì)胞治療中心；3.第一研究室 創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400042)

自體及健康人CIK細(xì)胞治療臨床惡性腫瘤的比較

李 壯1，董晨輝1，徐 祥2，何 靜2，黃 宏3，郭 韡3，邢 偉3，王愛民1*

(第三軍醫(yī)大學(xué) 第三附屬醫(yī)院 野戰(zhàn)外科研究所 1.關(guān)節(jié)四肢外科； 2.干細(xì)胞移植amp;細(xì)胞治療中心；3.第一研究室 創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400042)

目的比較惡性腫瘤患者和健康人來源的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK cells)體外抗瘤效應(yīng)和臨床療效。方法惡性腫瘤患者(n=12)和健康人(n=12)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)經(jīng)IFN-γ、CD3 Ab、IL-1和IL-2體外誘導(dǎo)獲得CIK，錐蟲藍(lán)染色檢測體外增殖，CCK-8檢測抑瘤活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型，PCR分析CIK在患者外周血的代謝，最后比較近期療效。結(jié)果健康人CIK較患者CIK體外增殖快、CD3+CD56+比例高且抑瘤效應(yīng)強(qiáng)(Plt;0.01)，能在患者外周血中存在5～8 周并有效改善其免疫機(jī)能，兩者近期療效無顯著差異。結(jié)論健康人CIK治療惡性腫瘤高效可行，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞；惡性腫瘤；T淋巴細(xì)胞亞群

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells, CIK cells)由單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)IFN-γ、CD3 Ab、IL-1和IL-2體外誘導(dǎo)得到，兼有NK細(xì)胞非MHC限制性殺瘤和T淋巴細(xì)胞的高抗瘤活性，臨床用于多種惡性腫瘤的治療[1-2]。目前，CIK主要由患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)誘導(dǎo)獲得，關(guān)于健康人CIK細(xì)胞的臨床應(yīng)用鮮有報(bào)道。本研究通過與惡性腫瘤患者CIK比較，以初步探討健康人CIK的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院2012 年4 月至2013 年4 月行CIK治療的24 例惡性腫瘤患者，男性10 例，女性14 例，平均年齡(60.2±14.3)歲，其中肺癌8 例，肝癌、胰腺癌、腎癌、卵巢癌和宮頸癌各2例，牙齦癌、胃癌、食道癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和骨肉瘤各1 例，KPS評(píng)分gt;60 分，預(yù)期生存gt;3 個(gè)月，臨床常規(guī)治療均結(jié)束4 周以上。根據(jù)CIK來源分為自體CIK及健康人CIK治療組，各12 例患者，后者包括8 名接受男性親屬CIK治療的女性患者。所有患者或其法定代理人簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，INF-γ(上海克隆高科公司)，CD3 Ab(Ebioscience公司)，IL-1(Schering Plough公司)，IL-2(北京四環(huán)生物公司)，熒光素標(biāo)記的抗體及IgG同型對照(Beckman Coulter公司)，CCK-8(南京凱基生物公司)，DP1801試劑盒(北京百泰克生物公司)。人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和人肝癌細(xì)胞系HepG2由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所提供。

1.3 主要方法

1.3.1 CIK細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[3]，當(dāng)14 d CIK擴(kuò)增達(dá)治療量且質(zhì)檢合格后離心收集細(xì)胞，以100 mL含1% 人血白蛋白的0.9%氯化鈉注射液重懸后靜脈輸注。每療程分3 次輸注，細(xì)胞總數(shù)gt;1010個(gè)。

1.3.2 CIK細(xì)胞增殖活性及表型的分析：3、7和14 d時(shí)錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，并取適量細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測表型。

1.3.3 CIK細(xì)胞體外抑瘤活性測定：以健康人PBMC、患者和健康人CIK為效應(yīng)細(xì)胞，HCT116和HepG2為靶細(xì)胞，效靶比為5∶1、10∶1、20∶1和40∶1，作用24 h后加入CCK-8，測量450 nm波長處A值。計(jì)算抑瘤率%=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞A值)/靶細(xì)胞A值]×100 %。

1.3.4 患者接受CIK治療前后T淋巴細(xì)胞亞群變化：采集患者治療前及治療4、8和12 周后100 μL外周血，加熒光素標(biāo)記的抗體及同型對照經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，以12 例平均年齡(61.2±13.6)歲健康人作為對照。

1.3.5 常規(guī)PCR檢測男性CIK輸注后女性患者外周血中SRY基因變化：8 例女性患者接受男性親屬CIK細(xì)胞治療前后采集100 μL外周血，以DP1801試劑盒提取DNA，設(shè)置正常男女對照。Y染色體性別決定基因(sex determining region on Y，SRY)引物序列(254 bp)：上游：5′-CATGAACGCATTCATCGTG TGGTC-3′，下游：5′-CTGCGGGAAGCAAACTGCAA TTCTT-3′，GAPDH(532 bp)作為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系含100 ng DNA，1 μL引物，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，取10 μL產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.6 臨床療效分析：參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，將患者治療60 d后KPS評(píng)分、疼痛強(qiáng)度和體質(zhì)量變化作為主要指標(biāo)，評(píng)估臨床收益反應(yīng)(clinical benefit response，CBR)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞的體外增殖和表型檢測

3 d起健康人CIK增殖和CD3+CD56+升高明顯快于患者細(xì)胞(Plt;0.01)(表1，2)。

表1 CIK細(xì)胞體外增殖倍數(shù)Table 1 Proliferation of CIK cells(±s, multiples, n=12)

*Plt;0.01 compared with autologous CIK.

表2 CIK培育過程中CD3+CD56+變化Table 2 Changes of CD3+CD56+ subset during culturing of CIK cells(±s, %, n=12)

*Plt;0.01 compared with autologous CIK.

2.2 CIK細(xì)胞體外抑瘤活性檢測

CIK對HCT116或HepG2的抑制活性與效靶比成正比，各個(gè)相應(yīng)效靶比健康人CIK抑瘤活性均強(qiáng)于自體CIK，PBMC效應(yīng)相對較弱(Plt;0.01)(圖1)。

2.3 患者治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群變化

與對照組相比，患者治療前CD3+、CD4+和NK降低，CD8+升高，CD4+/CD8+降低，CIK代償性升高。治療后以上指標(biāo)均有改善，健康人CIK治療組CD3+、CD4+改善更明顯，至12周左右降至治療前水平(表3)。

2.4PCR檢測異體CIK細(xì)胞治療后SRY在外周血中的變化

治療前8 例患者血中均未檢出SRY基因，治療后254 bp處可見目的條帶。其中在輸注后5、7和8周各有1例、5例和2例可檢出SRY(圖2)。

*Plt;0.01 compared with autologous CIK； #Plt;0.01 compared with PBMC圖1 PBMC、自體及健康人CIK對HCT116(A)和HepG2(B)抑制效應(yīng)的比較Fig 1 Comparison of cytotoxicity against HCT116(A) and HepG2(B) of PBMC, autologous or healthy

表3 患者接受自體或健康人CIK細(xì)胞治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化Table 3 Analysis of T lymphocyte subset of patients treated with autologous or healthy CIK (±s, %, n=12)

*Plt;0.01 compared with autologous CIK；#Plt;0.01 compared with healthy control.

M.DL2000；C1.female control；C2.male control；P.before infusion；0 day～9 weeks.after infusion圖2 常規(guī)PCR檢測女性患者接受男性CIK治療前后外周血中SRY基因Fig 2 Detecting SRY in peripheral blood of female patients treated with male-derived CIK by PCR

2.5 臨床療效評(píng)價(jià)及不良反應(yīng)

60 d時(shí)兩組患者KPS評(píng)分、疼痛和體質(zhì)量改善及CBR均無顯著差異(表4)。3 例自體CIK治療和5例健康人CIK治療的患者在回輸時(shí)出現(xiàn)低熱、寒戰(zhàn)，24 h內(nèi)自行恢復(fù)正常，1例健康人CIK治療的患者在2周后出現(xiàn)雙側(cè)脛前皮膚瘙癢，對癥處理后緩解。所有患者無心悸、胸悶、嘔吐和腹瀉等不適。

表4 自體及健康人CIK細(xì)胞治療組療效比較Table 4 Comparison of therapeutic effect betweenautologous and healthy CIK(%,n=12)

3 討論

手術(shù)和化放療仍是目前臨床治療惡性腫瘤的主要方法，但手術(shù)無法徹底清除腫瘤細(xì)胞，而放化療殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也損傷正常細(xì)胞，進(jìn)一步破壞機(jī)體免疫甚至降低生存質(zhì)量。作為配合臨床常規(guī)治療的重要手段，CIK細(xì)胞具有體外擴(kuò)增速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣和毒副作用小的特點(diǎn)，被認(rèn)為是腫瘤過繼免疫治療的新希望[5]。但晚期惡性腫瘤患者免疫功能常有不同程度抑制，外周血白細(xì)胞數(shù)量和活性降低，抽血分離PBMC可能會(huì)加重貧血和誘發(fā)感染。此外，由于細(xì)胞狀態(tài)受損及“腫瘤免疫編輯”[6]，自體CIK治療惡性實(shí)體腫瘤的有效性僅30%左右[7]，因此健康人CIK細(xì)胞是否可以作為一種安全有效的治療手段應(yīng)用于臨床也就成為關(guān)注的焦點(diǎn)[8]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)異體CIK細(xì)胞在受者體內(nèi)可持續(xù)存在約90 d，同時(shí)保持其抗腫瘤效應(yīng)而不引起明顯的不良反應(yīng)[9]，在本研究中，相較于惡性腫瘤患者CIK，健康人CIK細(xì)胞體外增殖速度快、CD3+CD56+比例高且抑瘤效應(yīng)強(qiáng)，輸注后能有效改善患者的免疫功能，在得到與自體CIK類似療效的同時(shí)并未明顯地增加不良反應(yīng)。盡管由于樣本量少和觀察周期短等原因，本研究中未發(fā)現(xiàn)健康人CIK具有更好的療效，此外有關(guān)自體CIK細(xì)胞在患者體內(nèi)的代謝還有待進(jìn)一步研究，但應(yīng)用健康人CIK細(xì)胞能夠避免抽血等對患者的損傷，縮短患者等待治療的時(shí)間以爭取治療時(shí)機(jī)，從而為晚期惡性腫瘤特別是伴明顯免疫機(jī)能受損的患者提供了一個(gè)實(shí)施CIK治療的新方法，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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Comparison of clinic application in malignant tumor immunotherapy between autologous and healthy CIK cells

LI Zhuang1, DONG Chen-hui1, XU Xiang2, HE Jing2, HUANG Hong3, GUO Wei3,XING Wei3, WANG Ai-min1*

(1.Dept. of Joint and Orthopedic Surgery; 2.Stem Cell Transplantation amp; Cell Treatment Center; 3.State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Dept. of Institute of Surgery Research, the Third Affilited Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400042,China)

ObjectiveTo compare the clinical anti-tumor effect of cytokine-induced killer cells(CIK) derived from patients with malignancies or healthy doners.MethodsPeripheral blood mononuclear cells(PBMC) of patients(n=12) or healthy doners(n=12) were cultured in presence of IFN-γ, CD3 Ab, IL-1 and IL-2. The proliferation was counted by Trypan blue test, theinvitroanti-tumor cytotoxicity was analysed by CCK-8 assay, the phenotypes were analyzed by flow cytometry, the duration of healthy CIK was determined by PCR, the clinical effects were compared.ResultsCompared with autologous CIK, healthy CIK showed higher proliferative ability and enhancedinvitroanti-tumor cytotoxicity(Plt;0.05), and led to an efficient recovery of immunologic function of recipients. 5～8 weeks after infusion, healthy CIK was also detected in recipients’ peripheral blood. More importantly, healthy CIK showed equivalent therapeutic effect and minimal adverse reactions.ConclusionsApplication of healthy CIK cells in the treatment of malignancies is probably feasible.

cytokine-induced killer cells; malignancy; T lymphocyte subset

2013-08-09

2013-10-30

國家自然科學(xué)基金(81372027)

*通信作者(correspondingauthor)： trauma2@163.com

1001-6325(2014)04-0475-05

研究論文

R 73-36； R 730.51； R 394.2

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