艾塞那肽通過調(diào)控PPARα及ACOX1改善大鼠非酒精性脂肪肝病癥狀

武俊紫，牛世偉，賈亞敏，陶文艷，柳 波，李 燕，李樹德

(1．昆明理工大學(xué) 昆華醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 云南 昆明 650504；2．云南省第一人民醫(yī)院 干部保健科，云南 昆明 650036； 3．太原理工大學(xué) 現(xiàn)代科技學(xué)院 教務(wù)處，山西 太原 030021；4．昆明醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 藥物化學(xué)系，云南 昆明 650504； 5．昆明醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 云南 昆明 650504)

艾塞那肽通過調(diào)控PPARα及ACOX1改善大鼠非酒精性脂肪肝病癥狀

武俊紫1,2，牛世偉1,2，賈亞敏3，陶文艷4，柳 波4，李 燕2*，李樹德5*

(1．昆明理工大學(xué) 昆華醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 云南 昆明 650504；2．云南省第一人民醫(yī)院 干部保健科，云南 昆明 650036； 3．太原理工大學(xué) 現(xiàn)代科技學(xué)院 教務(wù)處，山西 太原 030021；4．昆明醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 藥物化學(xué)系，云南 昆明 650504； 5．昆明醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 云南 昆明 650504)

目的研究艾塞那肽對(duì)高脂誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的作用。方法120只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(CON)、模型組(HFD)、艾塞那肽低、中、高劑量干預(yù)組(ELD、EMD、EHD)和陽性藥物多烯磷脂酰膽堿治療組(PDC)，每組20只，成功復(fù)制NAFLD模型后，給予相應(yīng)治療，治療4周和8周后分別處死大鼠各半，肝臟切片HE染色、相應(yīng)試劑盒檢測肝功能、血脂指標(biāo)，RT-PCR及Western blot測定PPARα及ACOX1的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果治療8周后，肝臟HE染色除ELD外，PDC、EMD及EHD看不到任何脂肪顆粒浸潤；治療4周后，PDC、ELD、EMD以及EHD組與HFD組相比，肝功能指標(biāo)AST、ALT與CHE，血脂指標(biāo)CHOL與TG，明顯降低(Plt;0.05)，8周后進(jìn)一步降低；治療后肝臟組織過氧化物酶增殖激活受體α(PPARα)和?；o酶A氧化酶1(ACOX1)表達(dá)有顯著改善。結(jié)論艾塞那肽可通過調(diào)控PPARα及ACOX1表達(dá)改善NAFLD大鼠癥狀。

艾塞那肽；非酒精性脂肪肝??；過氧化物酶增殖激活受體α；酰基輔酶A氧化酶1

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無酒精及其他明確原因所引起的肝臟脂代謝障礙型疾病[1]，其疾病譜較廣，包括單純性非酒精性脂肪肝病，非酒精性脂肪肝炎及與其相關(guān)的肝纖維化和肝功能衰竭等[2]。艾塞那肽是從鈍尾毒蜥蜴的唾液中提取的類似腸促胰島素的生物活性肽，其具有促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰高血糖素生成、刺激胰島B細(xì)胞的增殖與分化、抑制B細(xì)胞凋亡等多項(xiàng)生理功能[3]，另有研究顯示，艾塞那肽還具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用[4]，但關(guān)于其是否可以改善NAFLD癥狀，國內(nèi)外均沒有研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物來源：120只清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量160～180 g，昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供[合格證號(hào)：SYXK(滇)2011-0004]。

1.1.2 藥品與試劑：艾塞那肽注射液(Baxter Pharmaceutical Solutions LLC公司)；多烯磷脂酰膽堿注射液(賽諾菲安萬特制藥有限公司)；總膽固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和膽堿酯酶(CHE)試劑盒(Bio-Swamp公司)；總RNA提取試劑盒(天根公司)；引物(英俊生物公司)；抗體PPARα、ACOX1、β-actin及ECL發(fā)光試劑盒(Santa Cruz公司)；二抗(中杉金橋公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及藥量：120只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control，CON)、模型組(high-fat diet，HFD)、艾塞那肽低、中、高(Exenatide Low、Middle和High Dose，ELD、EMD和EHD)劑量干預(yù)組及陽性藥物多烯磷脂酰膽堿(positive drug polyene phosphatidylcholine，PDC)治療組，造模成功后CON組不予干涉，HFD組予0.9%氯化鈉注射液皮下注射，ELD、EMD和EHD組每天給予大鼠皮下注射艾塞那肽1、2和4 μg，PDC治療組給予多烯磷脂酰膽堿46 mg。

PPARα引物：上游：5′-CTTGTGCATGGCTGAGA AGA-3′，下游：5′-AATTCCGTGAGCTCGGTGAC-3′，產(chǎn)物長度132 bps。

ACOX1引物：上游： 5′-GAGATGGATAACGGCT ACCT-3′，下游：5′-AATTCCGTGAGCTCGGTGAC-3′，產(chǎn)物長度190 bps。

β-actin引物：上游：5′-GTGACGAGGCCCAGAGC AAGAG-3′，下游：5′-ACGCAGCTCATTGTAGAAGG TGTGG-3′，產(chǎn)物長度123 bps。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝臟切片HE染色

CON無任何脂滴浸潤現(xiàn)象，HFD有不同程度的細(xì)胞變性及脂肪空泡，4周時(shí)4個(gè)治療組脂肪空泡明顯減少；8周時(shí)治療組脂肪空泡進(jìn)一步減少，除ELD組外，PDC、EMD以及EHD4組看不到任何脂肪空泡(圖1)。

2.2 肝功能

PDC組、ELD、EMD以及EHD組與HFD組相比，AST、ALT與CHE 治療4周后明顯升高(Plt;0.05)，8周與4周趨勢一致(表1)。

2.3 血脂

CHOL與TG，4周時(shí)，PDC組、ELD、EMD以及EHD組較HFD組明顯降低(Plt;0.05)。8周后進(jìn)一步降低(表2)。

圖1 肝臟切片HE染色Fig 1 HE staining of liver(×100)

表1 肝功能檢查Table 1 Liver function check(±s,μmol / L, n=10)

*Plt;0.05 compared with HFD.

表2 血脂檢查Table 2 Blood lipids check(±s,μmol / L, n=10)

*Plt;0.05 compared with HFD.

2.4 肝臟組織PPARα及ACOX1 mRNA表達(dá)

2.4.1 RT-PCR檢測PPARαmRNA表達(dá)：PDC、ELD、EMD和EHD組與HFD組相比，4周后肝臟PPARαmRNA表達(dá)明顯升高(Plt;0.05)，但8周后除PDC外，ELD、EMD和EHD組沒有進(jìn)一步改善(圖2)。

2.4.2 RT-PCR檢測ACOX1 mRNA表達(dá):PDC組、ELD、EMD和EHD組與HFD組相比，4周后肝臟ACOX1 mRNA表達(dá)明顯升高(Plt;0.05)。8周時(shí)其mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高，但ELD、EMD和EHD表達(dá)均低于PDC組(圖3)。

2.5Westernblot檢測PPARα及ACOX1蛋白表達(dá)

2.5.1 Western blot檢測PPARα蛋白表達(dá)：PDC組、ELD、EMD和EHD組與HFD組相比， 4周后肝臟PPARα蛋白表達(dá)明顯升高(Plt;0.05)。8周后PDC組、ELD、EMD和EHD組PPARα的蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(圖4)。

2.5.2 Western blot檢測ACOX1 蛋白表達(dá)：與HFD組相比，4周時(shí)PDC組、ELD、EMD和EHD組肝臟PPARα蛋白表達(dá)明顯升高(Plt;0.05)，8周PDC組、ELD、EMD和EHD組PPARα的蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(圖5)。

*Plt;0.05 compared with HFD圖2 肝臟PPARα mRNA表達(dá)Fig 2 Liver PPARα mRNA expression

*Plt;0.05 compared with HFD圖3 肝臟ACOX1 mRNA表達(dá)Fig 3 Liver ACOX1 mRNA expression

*Plt;0.05 compared with HFD圖4 肝臟PPARα 蛋白表達(dá)Fig 4 Rat liver PPARα protein expression

*Plt;0.05 compared with HFD圖5 肝臟ACOX1 蛋白表達(dá)Fig 5 Liver ACOX1 protein expression

3 討論

NAFLD嚴(yán)重威脅著人們的健康，一般而言，輕度NAFLD患者有25%左右有疲乏感，如果不加干預(yù)，任由繼續(xù)發(fā)展，形成中度甚至重度NAFLD則會(huì)給患者帶來肝區(qū)隱痛、全身乏力、腹瀉等生活影響[5]，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為NAFLD的治療應(yīng)以控制飲食，增加運(yùn)動(dòng)等為主，但消除或控制與NAFLD相關(guān)的因素，如糖尿病、高血脂、肥胖等的藥物治療也不容忽視[6]。

PPARα作為PPARs家族的一員，在NAFLD的發(fā)病過程中扮演著重要的角色[7]，PPARα最大的功效為調(diào)節(jié)脂肪代謝，從而參與脂肪性肝病的發(fā)病[8]。ACOX1是脂肪細(xì)胞內(nèi)與脂肪酸氧化相關(guān)的酶，同時(shí)也是過氧化酶體內(nèi)β-氧化系統(tǒng)的起始酶[9]。本實(shí)驗(yàn)用高脂溶液灌胃SD大鼠建立NAFLD模型，艾塞那肽治療后，肝臟HE染色EMD和EHD組肝臟切片在8周時(shí)幾乎看不到任何脂肪空泡，同時(shí)艾塞那肽可明顯改善大鼠PPARα 及ACOX1的mRNA和蛋白表達(dá)，PPARα 及ACOX1表達(dá)的升高促使了其血脂功能的改善，隨著血清脂質(zhì)代謝的好轉(zhuǎn)，大鼠肝功能也發(fā)生了顯著地改善。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，用高脂飲食灌胃所形成的NAFLD大鼠模型，大鼠明顯具有脂代謝紊亂，肝功能異常等特征，艾塞那肽可明顯且快速的調(diào)節(jié)大鼠脂質(zhì)代謝，改善肝功能，有效的緩解了NAFLD相關(guān)癥狀，其機(jī)理可能是通過改善NAFLD大鼠PPARα及ACOX1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

[1] 胡云龍, 趙彩彥, 劉曉梅. 實(shí)驗(yàn)性脂肪性肝病大鼠血漿內(nèi)皮素與肝病理損 害的關(guān)系[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2005, 25:846-847.

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Exenatide treatment improves nonalcoholic fatty liver phenotype by regulation of PPARα and ACOX1

WU Jun-zi1,2, NIU Shi-wei1,2, JIA Ya-min3, TAO Wen-yan4, LIU Bo4, LI Yan2*, LI Shu-de5*

(1.Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, Collage of Kunhua Medicine, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650504;2.Dept. of Cadre Health Care, the First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650036; 3.Dept. of Dean’s Office,Polytechnic Institute, Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030021; 4.Dept. of Pharmaceutical Chemistry, Collage of Pharmacy, Kunming Medical University, Kunming 650504; 5.Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, Collage of Basic Medical, Kunming Medical University, Kunming 650504, China)

ObjectiveTo observe the exenatide effect on fat-induced nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) in rat.MethodsOne hundred and twenty SD rats were randomly divided into control group(CON), model group(HFD), exenatide low, medium, high dose group (ELD, EMD, EHD) and polyene phosphatidylcholine treatment group (PDC), each group was 20. After successfully established NAFLD, given appropriate treatment, half of the rats were sacrificed after 4 and 8 weeks. HE staining of liver slices, liver function test, blood lipids function, RT-PCR Western blot for PPARα and ACOX1 expression were performed.ResultsAfter 8 weeks of treatment, rat liver HE staining PDC, EMD and EHD had not any fat particles infiltration; after 4 weeks treatment, liver function AST, ALT and CHE, serum lipids CHOL and TG compared with HFD group, PDC, ELD, EMD and EHD,Plt;0.05,8 weeks further reduced; liver peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα) and acyl coenzyme A oxidase 1(ACOX1) expression has also undergone a significant improvement.ConclusionsExenatide improves NAFLD Phenotype by regulation of PPARα and ACOX1 expression.

exenatide, non-alcoholic fatty liver disease, peroxisome proliferator activated receptors α, acyl coenzyme a oxidase 1

2013-09-02

2013-10-25

國家自然科學(xué)基金(81360128;81360252)；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)(2011FB225)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究(2013FZ052;2013FZ183)

*通信作者(correspondingauthor)： liyanken@126.com; shudeli006@vip.sina.com

1001-6325(2014)04-0464-06

研究論文

R 575.5

A