甲醛對鼠BM-MSCs細(xì)胞系的遺傳毒性影響

舍雅莉，劉永琦，李 屹，李能蓮，王雅莉，張 立，駱亞莉

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院 系統(tǒng)生物學(xué)與中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化研究所 中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室 中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 遺傳研究所， 甘肅 蘭州 730000)

甲醛對鼠BM-MSCs細(xì)胞系的遺傳毒性影響

舍雅莉1*，劉永琦1，李 屹2，李能蓮1，王雅莉1，張 立1，駱亞莉1

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院 系統(tǒng)生物學(xué)與中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化研究所 中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室 中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 遺傳研究所， 甘肅 蘭州 730000)

目的研究甲醛對BM-MSCs的遺傳毒性，從而為甲醛導(dǎo)致白血病的發(fā)生提供生物學(xué)依據(jù)。方法采用噻唑藍(lán)比色(MTT)法檢測BM-MSCs的增殖活性；用彗星、KCl-SDS沉淀、姐妹染色單體互換(SCE)和微核(MN)檢測甲醛對BM-MSCs的遺傳毒性效應(yīng)。結(jié)果75～200 μmol/L甲醛可呈劑量依賴抑制BM-MSCs的增殖(Plt;0.01)，誘導(dǎo)BM-MSCs DNA斷裂效應(yīng)呈現(xiàn)先增高后降低趨勢，在125 μmol/L時(shí)，達(dá)到峰值，其中75～150 μmol/L甲醛作用較對照組顯著升高(Plt;0.01)；甲醛在≥125 μmol/L時(shí)可以明顯引起B(yǎng)M-MSCs DNA-蛋白交聯(lián)(DPCs)、SCE和MN的形成，較對照組顯著升高(Plt;0.01)。結(jié)論甲醛可抑制BM-MSCs的增殖活性，并且對BM-MSCs具有一定的遺傳毒性效應(yīng)。

甲醛；BM-MSCs；遺傳毒性

2012年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, IARC)再次重申：甲醛是A類致癌物質(zhì)，可以引起鼻咽癌和白血病的發(fā)生，但是引起白血病的生物學(xué)證據(jù)不足[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)是位于骨髓中的多能干細(xì)胞，不僅具有多向分化潛能，還能分泌細(xì)胞外基質(zhì)及多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的正常增殖和分化，從而維持骨髓造血微環(huán)境的穩(wěn)定性。甚至有報(bào)道，BM-MSCs的數(shù)量減少也會引起造血干細(xì)胞的數(shù)量和功能發(fā)生改變[2]。因此，假設(shè)甲醛對BM-MSCs產(chǎn)生細(xì)胞或遺傳毒性效應(yīng)，那么BM-MSCs就會失去對造血干細(xì)胞的正常調(diào)控，從而可能導(dǎo)致白血病的發(fā)生。然而，到目前為止，甲醛對BM-MSCs的毒性作用還未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs，ATCC)；37%甲醛(50-00-0)、十二烷基肌氨酸鈉(137-16-6)和碘化丙啶(P4170)(Sigma公司)；DMEM/F-12培養(yǎng)基(NXL0742)(Hyclone公司)；MTT(0793)、低熔點(diǎn)瓊脂糖(A8350)、秋水仙堿(64-86-8)和5-Brdu(B8010)(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：用DMEM/F-12完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)BM-MSCs，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組用無血清DMEM/F-12將甲醛稀釋到工作液的濃度，對細(xì)胞進(jìn)行染毒，對照組采用不含甲醛的DMEM/F-12進(jìn)行培養(yǎng)。MTT(噻唑藍(lán)比色)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組分為25、50、75、100、125、150、175和200 μmol/L甲醛組；彗星實(shí)驗(yàn)、KCl-SDS沉淀實(shí)驗(yàn)、SCE和MN實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組分為75、100、125、150、175和200 μmol/L甲醛組。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性：細(xì)胞數(shù)調(diào)整到4×103個(gè)/孔，接種于96孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入不同濃度的甲醛，繼續(xù)培養(yǎng)6、12和24 h，然后加入MTT 20 μL，孵育4 h。棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)振蕩，酶標(biāo)儀測定在570 nm處的吸光度(A)值，根據(jù)公式計(jì)算各濃度甲醛處理組的細(xì)胞存活率[3]：(甲醛處理組A值/對照組A值)×100%。MTT實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.3 彗星實(shí)驗(yàn)檢測DNA鏈斷裂情況：具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，用彗星實(shí)驗(yàn)分析軟件CASP1.2.3對采集的圖片進(jìn)行分析，每個(gè)處理組隨機(jī)選取50個(gè)細(xì)胞。并釆用國際公認(rèn)的Olive 尾矩(Olive Tail Moment，OTM)值對DNA鏈的斷裂進(jìn)行評價(jià)。OTM 值等于彗星頭尾部密度重心間距離×彗尾DNA含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 KCl-SDS沉淀實(shí)驗(yàn)檢測DNA-蛋白交聯(lián)(DNA-protein crosslinks, DPCs)形成情況：具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行，用熒光分光光度儀在353 nm激發(fā)光和455 nm發(fā)射光下測得各甲醛處理組的熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量自由DNA和交聯(lián)DNA，用以下公式計(jì)算DPCs水平，DPCs=交聯(lián)DNA/(交聯(lián)DNA+自由DNA)×100%，以此值表示DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)的程度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 姐妹染色單體互換實(shí)驗(yàn)(sister chromatid exchange test，SCE)：具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，選擇染色體分散和差別染色良好、數(shù)目為40條的中期分裂相進(jìn)行拍照和觀察計(jì)數(shù)，凡在染色體端部出現(xiàn)的交換計(jì)為1個(gè)SCE，中部出現(xiàn)的交換計(jì)為2個(gè)SCE，著絲粒處發(fā)生的交換在判明不是兩個(gè)染色單體扭轉(zhuǎn)者計(jì)為1個(gè)SCE。各甲醛處理組計(jì)數(shù)30個(gè)中期分裂相，結(jié)果以平均每個(gè)中期分裂相的SCE數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 微核實(shí)驗(yàn)(Micronucleus test，MN)：具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行，每張玻片隨機(jī)觀察細(xì)胞1 000個(gè)，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)微核的細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞中含有的微核多數(shù)呈圓形，邊緣光滑整齊，直徑為主核的1/16～1/3，無折光性，與主核不相連，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可以出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)微核。計(jì)算方法如下：微核細(xì)胞率(‰)=具有微核的細(xì)胞總數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×1000‰。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 甲醛對BM-MSCs增殖活性的影響

當(dāng)甲醛濃度≥75 μmol/L作用12和24 h后，細(xì)胞存活率呈劑量依賴關(guān)系顯著下降(Plt;0.01)，而當(dāng)甲醛作用6 h，只在≥150 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率較對照組明顯下降(Plt;0.01)。另外，甲醛作用12和24 h的細(xì)胞活性變化不明顯，無時(shí)間依賴關(guān)系。因此，選擇75～200 μmol/L甲醛作用12 h的BM-MSCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1)。

*Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with control group圖1 甲醛對BM-MSCs增殖活性的影響Fig 1 Effect of formaldehyde on BM-MSCs viability

2.2 甲醛對BM-MSCs DNA斷裂的影響

75～200 μmol/L甲醛作用BM-MSCs 12 h后，DNA斷裂效應(yīng)呈現(xiàn)先增高后降低趨勢，在125 μmol/L時(shí)，OTM值達(dá)到峰值。其中75～150 μmol/L甲醛作用時(shí)，DNA斷裂程度較對照組顯著升高(Plt;0.01)(表1，圖2)。

2.3 甲醛對BM-MSCs DPCs的影響

甲醛在75～200 μmol/L時(shí)，導(dǎo)致DPCs水平逐漸升高，在≥125 μmol/L時(shí)，顯著高于對照組(Plt;0.01)(表1)。

A.control group; B.75 μmol/L formaldehyde group; C.125 μmol/L formaldehyde group; D.175 μmol/L formaldehyde group圖2 BM-MSCs經(jīng)甲醛染毒后的彗星實(shí)驗(yàn)圖片F(xiàn)ig 2 Images of BM-MSCs were treated with formal- dehyde by the comet assay (×400)

2.4 甲醛對BM-MSCs SCE的影響

125～200 μmol/L之間甲醛可以導(dǎo)致BM-MSCs每個(gè)中期分裂相的SCE數(shù)目較對照組顯著增加(Plt;0.01)(表1，圖3)。

2.5 甲醛對BM-MSCs MN的影響

75～200 μmol/L甲醛作用BM-MSCs形成微核率從3.768‰～41.432‰，呈逐漸增高趨勢，在≥125 μmol/L時(shí)較對照組顯著增高(Plt;0.01)(表1，圖4)。

3 討論

大量體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，甲醛對人鼻黏膜上皮細(xì)胞、骨髓祖細(xì)胞及鼠肺成纖維V79細(xì)胞等具有明顯的細(xì)胞毒性能夠抑制細(xì)胞增殖[4,7-8]。而且甲醛對人血細(xì)胞和骨髓祖細(xì)胞發(fā)揮生長抑制作用的毒性相關(guān)濃度大都在100～200 μmol/L濃度之間，這可能與甲醛在人血清中的正常濃度為13～97 μmol/L有關(guān)[9]。

表1 甲醛對BM-MSCs的遺傳毒性影響Table 1 Genotoxic effect of formaldehyde on BM-MSCs(±s)

*Plt;0.01 compared with control group.

A.control group; B.75 μmol/L formaldehyde group; C.125 μmol/L formaldehyde group; D.175 μmol/L formaldehyde group圖3 BM-MSCs經(jīng)甲醛染毒后的SCE實(shí)驗(yàn)圖片F(xiàn)ig 3 Images of BM-MSCs were treated with formal- dehyde by SCE test(×1000)

A.control group; B.75 μmol/L formaldehyde group; C.125 μmol/L formaldehyde group; D.175 μmol/L formaldehyde group圖4 BM-MSCs經(jīng)甲醛染毒后的MN實(shí)驗(yàn)圖片F(xiàn)ig 4 Images of BM-MSCs were treated with formal- dehyde by MN test(×400)

MTT結(jié)果表明，25～50 μmol/L甲醛在6、12和24 h對細(xì)胞的生長都沒有明顯影響，甚至在作用6 h后細(xì)胞存活率有一定程度的升高，這可能與內(nèi)源性甲醛在血清中存在一定的本底水平有關(guān)，用來維持細(xì)胞正常的生命活動(dòng)，所以不會對細(xì)胞造成影響。75～200 μmol/L甲醛作用12和24 h時(shí)對細(xì)胞增殖有明顯抑制，并且隨著甲醛濃度的升高，增殖活性逐漸下降，呈明顯的劑量依賴關(guān)系，但是這個(gè)濃度范圍與甲醛對人血和骨髓細(xì)胞產(chǎn)生毒性的相關(guān)濃度100～200 μmol/L略有差異，原因可能為：1)甲醛在小鼠血清中的正常值低于人血清中的正常值13～97 μmol/L。2)小鼠的BM-MSCs對甲醛更敏感，于是75 μmol/L甲醛可以對小鼠BM-MSCs產(chǎn)生細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞增殖。由于25和50 μmol/L甲醛對BM-MSCs的增殖活性無明顯影響，并且甲醛作用12和24 h的增殖活性無明顯差別，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇75～200 μmol/L甲醛作用12 h的BM-MSCs進(jìn)行研究。

DPCs是目前公認(rèn)甲醛導(dǎo)致DNA損傷的主要形式[10]，在正常細(xì)胞中，DPCs具有一定的濃度水平，DPCs對維持正常的DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和細(xì)胞生長具有重要作用，然而甲醛能否引起DNA鏈斷裂仍然存在爭議。在本研究中，KCl-SDS沉淀檢測了甲醛對BM-MSCs的DPCs效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)甲醛在125～200 μmol/L之間可以明顯呈濃度依賴方式引起DPCs的形成。標(biāo)準(zhǔn)的堿性彗星實(shí)驗(yàn)檢測DNA斷裂效應(yīng)，結(jié)果顯示，在甲醛濃度低于125 μmol/L時(shí)，DNA斷裂效應(yīng)逐漸增加，當(dāng)甲醛濃度大于125 μmol/L時(shí)，DNA斷裂效應(yīng)逐漸降低，這與報(bào)道一致[11]。然而有意思的是，KCl-SDS沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，甲醛濃度大于125 μmol/L時(shí)，可以明顯引起DPCs效應(yīng)產(chǎn)生，且隨著甲醛濃度升高而增加。因此，認(rèn)為甲醛誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA斷裂片段可能與蛋白質(zhì)發(fā)生了交聯(lián)，形成DPCs加合物，抑制了DNA的遷移，使堿性彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果受到抑制。此外，175 μmol/L和200 μmol/L甲醛作用時(shí)，OTM值低于對照組水平，這也可能與175 μmol/L和200 μmol/L時(shí)，甲醛引起DPCs顯著增高有關(guān)。

有研究報(bào)道，甲醛暴露的人群鼻腔和口腔脫落細(xì)胞中微核率增加，而外周血中微核率和SCE均無明顯增加[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，125～200 μmol/L甲醛可以明顯引起B(yǎng)M-MSCs SCE和微核率的增加，尤其在甲醛175和200 μmol/L時(shí)升高更為明顯。

本研究結(jié)果表明，甲醛對BM-MSCs具有一定的遺傳毒性作用，有望為研究甲醛導(dǎo)致白血病的發(fā)生提供生物學(xué)依據(jù)，但具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Genotoxic effect of formaldehyde on mouse BM-MSCs

SHE Ya-li1*, LIU Yong-qi1, LI Yi2, LI Neng-lian1, WANG Ya-li1, ZHANG Li1, LUO Ya-li1

(1.Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacology and Toxicology, Basis Room of Integration of Traditional and Western Medicine, Institute of Systems Biology and TCM Transformation, Gansu University of Traditional Chinese Medicine;2.Institute of genetics, School of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

ObjectiveTo find potential genotoxic effect of formaldehyde on BM-MSCs, for providing the biological evidence for the formaldehyde to lead to leukemia.MethodsProliferation activity was measured by MTT assay; Genotoxic effect was detected by comet assay, KCl-SDS precipitation assay, sister chromatid exchange (SCE) test and micronucleus (MN) test.Results75～200 μmol/L formaldehyde can inhibit the BM-MSCs proliferation in a dose-dependent manner (Plt;0.01); DNA strand breakage increased gradually at increasing concentrations below 125 μmol/L, however, when formaldehyde concentration was over 125 μmol/L, DNA strand breakage decreased. There were significant rises in 75～150 μmol/L formaldehyde groups compared with control group (Plt;0.01); Induction of DNA-protein crosslinks (DPCs), SCE and MN in ≥125 μmol/L formaldehyde groups were significant higher than in control group (Plt;0.01).ConclusionsFormaldehyde can inhibite the BM-MSCs proliferation activity, and have a genotoxic effect on the BM-MSCs.

formaldehyde; BM-MSCs; genotoxicity

2013-11-21

2013-12-20

國家自然科學(xué)基金(81060351/H2810)；甘肅省教育廳科研基金(0906-03)；甘肅中醫(yī)學(xué)院中青年基金(09ZQ-2)

*通信作者(correspondingauthor)： sheyali@sina.com

1001-6325(2014)04-0454-05

研究論文

R 135.1

A