• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    石杉堿甲快速檢測酶聯(lián)免疫試劑盒的制備①

    2014-11-27 10:25:46余宇燕鄒艷輝邱亞利滕海英福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院福州350122
    中國免疫學(xué)雜志 2014年1期
    關(guān)鍵詞:甲片石杉單克隆

    余宇燕 鄒艷輝 邱亞利 滕海英(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福州350122)

    石杉堿甲(Huperzine A,HupA)是從石杉科石杉屬植物蛇足石杉[Huperzina serrata(Thumb.)Trev]的酚性部分中提取的一種新型石松類天然生物堿。作為第二代乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)抑制劑,具有高效、高選擇性、可逆性等特點[1,2]。目前石杉堿甲主要用于阿爾茲海默病(Alzheimer's disease,AD)的治療,可顯著改善記憶功能損傷和行為與心境障礙。國內(nèi)外學(xué)者研究證實,石杉堿甲對血管性癡呆(Vascular dementia,VD)、智力低下、精神分裂癥及重癥肌無力等患者有一定的治療作用[3]。

    目前測定 HupA 最常用的方法是色譜法[4,5],但需要繁瑣的樣品處理步驟、昂貴的儀器以及專業(yè)的操作技能,不適合用于批量樣品的快速篩選和檢測。而免疫分析法具有簡單、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點,國外已發(fā)明各種快速檢測試劑盒且技術(shù)成熟,國內(nèi)的免疫分析快速檢測試劑盒技術(shù)研究也逐步發(fā)展。本實驗采用自制石杉堿甲人工抗原[6]免疫實驗動物,獲得具有較高效價和特異性石杉堿甲單克隆抗體,建立間接競爭酶聯(lián)免疫法,研制能快速檢測HupA的間接競爭法酶聯(lián)免疫試劑盒,該方法對儀器設(shè)備和人員操作的要求較低,檢測成本低,能夠滿足對大批量樣品檢測的需要。

    1 材料與方法

    1.1 儀器和試劑 酶標(biāo)儀680(美國Bio-Rad公司);電泳儀、垂直電泳槽(美國 Bio-Rad公司);TGL-16G型高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);PHS-3C型精密pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

    試驗動物5~6周齡,BALB/c雌性小鼠,由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。SP2/0骨髓瘤細胞由上海友科生物技術(shù)公司提供。石杉堿甲(純度>99%,萬邦藥業(yè)有限公司);士的寧、烏頭堿、次烏頭堿、延胡索乙素、小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所);HupA-BSA免疫原(自制);弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鼠源性單克隆抗體亞型檢測試劑盒(美國Sigma公司);Protein G親和層析柱(GE公司);羊抗鼠酶標(biāo)二抗(上海友科生物技術(shù)有限公司);Super-Bradford蛋白定量試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司);石杉堿甲片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司,批號:120301);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 單克隆抗體的制備 用HupA-BSA免疫原與弗氏完全佐劑(弗氏不完全佐劑)等體積乳化后,皮下、肌肉多點免疫BALB/c小鼠,每兩周加強免疫一次,免疫4~6次,檢測其效價。將效價高的小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在聚乙二醇(PEG)下融合,獲得陽性雜交瘤細胞。加入小鼠腹腔飼養(yǎng)細胞與融合細胞共培養(yǎng),并篩選陽性株。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化,直到得到能穩(wěn)定分泌抗石杉堿甲抗體的雜交瘤細胞株。采用小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)法生產(chǎn)單克隆抗體,將雜交瘤細胞注入預(yù)先腹腔注射液體石蠟的小鼠腹腔內(nèi),7~10 d后腹腔下圍穿刺回收腹水。采用辛酸硫酸銨沉淀法、Protein G親和層析法純化抗體,檢測抗體效價和純度[7]。按照Sigma公司鼠源性單克隆抗體亞型檢測試劑盒的步驟對所制備抗體的亞型進行鑒定。

    1.3 ELISA基本程序 用pH9.6的碳酸鹽緩沖液將包被抗原稀釋,以 100 μl/孔,4℃過夜;用 PBST(含0.05%Tween 20 的 pH7.2 PBS)洗板 3 次,拍干,加入封閉液,200 μl/孔,37℃ 孵育 2 h;用 PBST洗板3次,拍干,加入用PBST倍比稀釋的抗體100 μl/孔(或不同濃度的石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)溶液及倍比稀釋的抗體各50 μl),37℃孵育1 h;用 PBST洗板3次,拍干,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)二抗,100 μl/孔,37℃孵育40 min;用PBST洗板3次,拍干;迅速加入新鮮配制的TMB顯色液,100 μl/孔,37℃孵育10~15 min,顯色到一定程度時,及時加入 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),50 μl/孔。靜置 5 min,使反應(yīng)終止徹底、顏色均一。在酶標(biāo)測定儀上,于450 nm測吸光值,以空白孔調(diào)零,測定各孔的OD450值[8]。陰性對照用免疫前的小鼠血清,空白對照為PBS。每一稀釋比的供試品設(shè)置3個平行。

    1.4 ELISA方法的確定

    1.4.1 最佳抗體的選擇 根據(jù)純化后抗體的效價結(jié)果,選擇OD450值接近1.0的抗體稀釋倍數(shù)作為ELISA工作條件,選擇IC10最低的單克隆抗體作為最佳抗體。

    1.4.2 包被抗原和抗體稀釋倍數(shù)的確定 采用方陣滴定法,包被緩沖液梯度稀釋包被抗原后縱向加入酶標(biāo)板,稀釋倍數(shù)分別為 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 000,4℃ 包被過夜;PBST 梯度稀釋抗體后橫向加入酶標(biāo)板,稀釋倍數(shù)分別為1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶7 000、1∶8 000。以倍比稀釋的包被抗原和抗體稀釋液進行ELISA檢測,反應(yīng)后比較各組的OD450值,以O(shè)D450值接近1.0時的包被抗原和抗體稀釋倍數(shù)為ELISA最佳工作條件。

    1.4.3 酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的選擇 按上述確定的最佳反應(yīng)條件,選擇酶標(biāo)二抗的稀釋度為1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000。以 OD450值接近 1.0時的酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為最佳ELISA工作條件。

    1.4.4 TMB底物作用時間的選擇 按上述確定的最佳工作反應(yīng)條件進行實驗,加入TMB底物反應(yīng)液,分別孵育 5、10、15、20 min顯色,終止。根據(jù)每組陽、陰性的OD450值的比值(P/N),確定TMB底物的最佳作用時間。

    1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 試劑盒對不同濃度的HupA 標(biāo)準(zhǔn)液(1、5、10、50、100、500、1 000、2 500 ng/ml)進行檢測。以HupA標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,求出相應(yīng)的相關(guān)指數(shù)和回歸方程。

    1.5 HupA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成 試劑盒主要由以下內(nèi)容組成:①HupA-OVA包被的96孔酶標(biāo)板,1塊;②HupA標(biāo)準(zhǔn)液:濃度為0.1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,5 ml/瓶,1 瓶,臨用前配制成 1、5、10、50、100、500、1 000、2 500 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液;③HupAMcAb:含有 0.1~ 1.0 μg/ml的抗體,10 ml/瓶,1瓶;④酶結(jié)合物工作液:HRP標(biāo)記的羊抗鼠稀釋液,10 ml/瓶,1瓶;⑤TMB顯色劑:顯色A(10 mg TMB溶于 10 ml無水乙醇)、B液(檸檬酸 0.51 g;Na2HPO4·12H2O 1.84 g;H2O20.1 ml;高純水 10 ml,混勻),10 ml/瓶,各 1 瓶;⑥終止液:2 mol/L H2SO4,6 ml/瓶,1 瓶;⑦洗滌液:0.01 mol/L pH7.2~7.4 PBST,200 ml/瓶,1 瓶。試劑盒于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.6 試劑盒的方法學(xué)考察

    1.6.1 靈敏度試驗 隨機選擇20個孔檢測HupA標(biāo)準(zhǔn)品零含量,X即所得20個孔OD450值的平均值,SD是標(biāo)準(zhǔn)差,檢測限即為X-3SD所對應(yīng)的濃度,進行10次標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗。

    1.6.2 精密度試驗 依據(jù)已確立的反應(yīng)體系和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,隨機選擇3塊酶標(biāo)板,每塊抽出5個微孔,測定50 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD450值,計算其平均值和變異系數(shù)。

    1.6.3 重復(fù)性試驗 石杉堿甲片樣品溶液:取石杉堿甲片20片,精密稱定,研細,精密稱取細粉適量(約相當(dāng)于石杉堿甲50 μg)置50 ml容量瓶中。加5 ml甲醇,振搖超聲30 min,加 PBST定容,搖勻。精密量取1 ml置10 ml容量瓶,加PBST定容,作為石杉堿甲片提取液。取石杉堿甲片樣品6份,每份樣品平行5次,測定樣品溶液的OD450值,計算其含量和變異系數(shù)。

    1.6.4 保存期測定 在不同時間取試劑盒進行檢測其吸光值的變化,以判斷試劑盒的保存期限。

    1.6.5 交叉反應(yīng)率 HupA結(jié)構(gòu)復(fù)雜,故采用其與幾種常見生物堿進行交叉反應(yīng)率試驗,從而反映其特異性。分別取HupA和其他生物堿(士的寧、烏頭堿、次烏頭堿、延胡索乙素及小檗堿)標(biāo)準(zhǔn)溶液,利用檢測試劑盒進行檢測,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,從曲線上查出50%OD450值所對應(yīng)的競爭物的濃度即為IC50值。根據(jù)下列公式計算HupA與其他生物堿的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率CR%=IC50HupA/IC50類似物×100%。

    1.6.6 回收率試驗 依據(jù)已確立的反應(yīng)體系和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,測定添加了80%、100%、120%3個濃度的石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品的樣品,每個濃度做3份,每份樣品平行3次,計算藥物含量、添加回收率和變異系數(shù)。

    1.7 樣品測定

    1.7.1 試劑盒測定石杉堿甲片中石杉堿甲的含量

    用已研制的試劑盒對石杉堿甲片樣品溶液進行檢測,平行測3次,根據(jù)OD450值計算石杉堿甲片中石杉堿甲的含量。

    1.7.2 HPLC法測石杉堿甲片中石杉堿甲的含量精密稱取HupA標(biāo)準(zhǔn)品1.01 mg,置于10 ml容量瓶中加入2%酒石酸使溶解,定容,作為對照品貯備液(含HupA 0.101 mg/ml),并分別稀釋成 1、6、12、18、24 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    HPLC法的色譜條件:日本島津LC-20A型高效液相色譜儀,Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動相為甲醇 -0.08 mol/L 醋酸銨溶液(30∶70)。設(shè)定流速為0.8 ml/min,檢測波長308 nm,進樣量20 μl,柱溫30℃。將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和石杉堿甲片提取液,按上述條件依次上樣。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立回歸方程式,根據(jù)方程式計算石杉堿甲片中石杉堿甲的含量。

    2 結(jié)果

    2.1 單克隆抗體的制備 融合前3 d對小鼠血清進行效價與特異性檢測。選取效價高(>105)、抑制率好的小鼠進行沖擊免疫。取沖擊免疫后的小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合,融合率約為45.2%。ELISA法檢測細胞上清液,選擇陽性孔再進行抗石杉堿甲抗體特異性檢測,選擇抑制率高的孔用有限稀釋法進行4次亞克隆,篩選到四株效價與特異性均較好的單克隆細胞株,命名為3E02、4B01、5D03和4C04。對四株細胞株擴大培養(yǎng),制備腹水并用Protein G親和層析法純化抗體。

    2.2 單克隆抗體性質(zhì)鑒定

    2.2.1 效價的測定 將純化前的腹水和純化后的抗體以相同的濃度梯度進行稀釋,ELISA方法測定效價,結(jié)果3E02、4B01、5D03和4C04純化前的效價分別為 1∶256 000、1∶128 000、1∶128 000 和1∶128 000,純化后的效價為 1∶128 000、1∶32 000、1∶32 000和1∶32 000。純化后的腹水效價較純化前有所下降,可能是在純化時進行適當(dāng)?shù)南♂尯屯肝?,使其效價降低。

    2.2.2 純度鑒定 腹水經(jīng)Protein G親和層析法純化后,抗體純度較高,抗體二硫鍵斷開后的重鏈分子質(zhì)量約為50 kD,輕鏈分子質(zhì)量約為25 kD,可用于分析相關(guān)特性。

    2.2.3 蛋白質(zhì)含量測定 根據(jù) Bradford法檢測Protein G親和層析法純化后的單克隆抗體濃度,其結(jié)果見表1。

    2.2.4 免疫球蛋白亞型鑒定 結(jié)果如表2所示:3E02的亞類為 IgG2b、kappa、4B01的亞類為 IgG2b、kappa;5D03的亞類為IgG1、kappa;4C04的亞類為IgG1、lamda。

    表1 單克隆抗體純化后蛋白質(zhì)含量Tab.1 Protein content of purified McAb

    表2 單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果Tab.2 Subclassing test results of anti-melamine McAb

    表3 試劑盒保存期試驗結(jié)果Tab.3 Validity of ELISA kits

    表4 交叉反應(yīng)試驗Tab.4 Cross reactivity of antibody for compounds

    2.3 ELISA最佳工作條件的確定

    2.3.1 最佳抗體的選擇 單克隆抗體中3E02、4B01、5D03和4C04的稀釋倍數(shù)分別為1∶8 000、1∶4 000、1∶4 000、1∶2 000,進行 ELISA。結(jié)果選擇IC10=5.163最低的5D03為最佳抗體。

    2.3.2 包被抗原和抗體稀釋倍數(shù)的確定 采用方陣滴定法進行ELISA測定,確定包被抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù),分析表中結(jié)果,發(fā)現(xiàn)有1∶100(1∶5 000)、1∶200(1∶5 000)、1∶400(1∶4 000)及 1∶800(1∶3 000)的OD450值在1.0左右,綜合各方面原因,選擇包被抗原稀釋倍數(shù)為1∶200,抗體稀釋倍數(shù)為1∶5 000作為最佳工作條件。

    2.3.3 酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的選擇 通過倍比稀釋的酶標(biāo)二抗進行ELISA檢測,比較各組的OD450值,以O(shè)D450值接近1.0時的酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為最佳ELISA工作條件,本試驗選擇酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為1∶10 000。

    2.3.4 TMB底物作用時間的選擇 對不同的底物作用時間進行考察,如比較各組的OD450值,結(jié)果以P/N最大時的TMB底物作用時間為最佳ELISA工作條件,本試驗選擇TMB底物作用時間為15 min。

    2.4 ELISA方法學(xué)考察

    2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以HupA標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo),以抑制率為 Y軸作圖,其中,抑制率=(參照 OD450-待測 OD450)/參照 OD450×100%,得到石杉堿甲的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=0.363x-0.237 7,R=0.992 0,其線性范圍為:5~2 500 ng/ml。

    2.4.2 靈敏度試驗 進行10次標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗,最終結(jié)果檢測限為6.242 ng/ml。

    2.4.3 精密度試驗 隨機取3塊不同的96孔酶標(biāo)板,變異系數(shù)分別為 1.2%、1.0%、1.2%,結(jié)果在允許范圍之內(nèi),結(jié)果較為可靠。

    2.4.4 重復(fù)性試驗 石杉堿甲片樣品6份的含量平均值為359.103 μg/g和變異系數(shù)為 7.1%,變異系數(shù)在允許范圍之內(nèi),結(jié)果較為可靠。

    2.4.5 保存期試驗 在不同時間取試劑盒進行檢測,其吸光值的變化如表3,試劑盒在4℃或-20℃下至少可保存6個月以上。

    2.4.6 交叉反應(yīng)率試驗 交叉反應(yīng)率測定結(jié)果見表4,HupA與其他生物堿的交叉反應(yīng)率均小于

    0.01%,說明其特異性高。

    2.4.7 回收率試驗 石杉堿甲的回收率實驗結(jié)果在94.2%~108.6%之間,變異系數(shù)范圍在2.3%~4.8%之間。結(jié)果表明變異系數(shù)在允許范圍之內(nèi),方法可行。

    2.5 樣品測定

    2.5.1 試劑盒測石杉堿甲片中石杉堿甲的含量利用試劑盒對石杉堿甲片提取液進行檢測,平行進行3次,根據(jù) OD450值,計算石杉堿甲片含量為358.402 μg/g。

    2.5.2 HPLC法測石杉堿甲片中石杉堿甲的含量

    以濃度X(μg/ml)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制HPLC法的標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=59 171x-40 514,r=0.999 3。根據(jù)回歸方程來計算石杉堿甲片中 HupA 的含量為368.430 μg/g。

    3 討論

    本試驗利用制備的HupA人工抗原免疫動物,將免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合,獲取HupA的單克隆抗體,建立HupA酶聯(lián)免疫分析法,并制備HupA檢測試劑盒。經(jīng)HPLC法驗證,樣品的試劑盒檢測結(jié)果與HPLC的測定結(jié)果基本一致,本試驗結(jié)果可信,并且靈敏度遠高于HPLC[9]。因為HupA試劑盒具有樣品前處理簡便,靈敏,經(jīng)濟,樣品量少,可實現(xiàn)高通量篩選以及可用于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點,可能成為測定中藥及其制劑中HupA含量的強有力工具,從而對其進行質(zhì)量控制和藥理標(biāo)準(zhǔn)化研究。

    [1]Zhang HY,Tang XC.Neruoprotective effects of huperzine A:new therapeutic targets for neurodegenerative disease[J].Trends Pharmacol Sci,2006,27(12):619-625.

    [2]鄭 如,蘇銀法.石杉堿甲的臨床應(yīng)用研究進展[J].實用藥物與臨床,2008,11(2):107-108.

    [3]shah RS,Lee HG,Xiongwei Z,et al.Current approaches in the treatment of Alzheimer’s disease[J].Biomed Pharmacother,2008,62(4):199-207.

    [4]Borloz A,Marston A,Hostettmann K.The determination of huperzine A in European Lycopodiaceae species by HPLC-UV-MS[J].Phytochem Anal,2006,17(5):332-336.

    [5]Zhang Y,Xie J,Chen WQ,et al.Development of a sensitive highperformance liquid chromatographic method with simple extraction for simultaneous determination of huperzine A and huperzine B in the species containing lycopodium alkaloids[J].J AOAC Int,2009,92(4):1060-1063.

    [6]滕海英,余宇燕,盧 玲,等.戊二醛法合成石杉堿甲人工抗原及其鑒定[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,22(6):41-44.

    [7]胡 鯤,黃宜運,姜有聲,等.環(huán)丙沙星單克隆抗體的制備及其免疫學(xué)特性分析[J].中國免疫學(xué)雜志,2010,26(6):538-543.

    [8]李金明.臨床酶免疫測定技術(shù)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2005:90-93.

    [9]高 青,周立春,夏 瑞,等.高效液相色譜法測定石杉堿甲片的含量及有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報,2004,35(4):338-340.

    猜你喜歡
    甲片石杉單克隆
    俏奶奶
    俏奶奶
    單克隆抗體在新型冠狀病毒和其他人冠狀病毒中的研究進展
    HPLC法同時測定降糖甲片中9種成分
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:14
    石杉堿甲治療血管性癡呆的有效性與安全性Meta分析
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:12:19
    HPLC法同時測定17種石杉亞科植物石杉堿甲、乙
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:27
    抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
    TSH受體單克隆抗體研究進展
    單克隆抗體制備的關(guān)鍵因素
    石杉堿甲聯(lián)合尼麥角林治療血管性癡呆的效果觀察
    在线播放国产精品三级| 午夜免费观看网址| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 亚洲在线观看片| 午夜激情欧美在线| 午夜福利在线观看吧| 色播亚洲综合网| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产成人系列免费观看| 精品国产亚洲在线| 特级一级黄色大片| 日日夜夜操网爽| 99热精品在线国产| 日韩精品中文字幕看吧| 好男人电影高清在线观看| 一a级毛片在线观看| 亚洲av美国av| 69av精品久久久久久| 性色avwww在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 国产成人啪精品午夜网站| 中文字幕久久专区| 成年版毛片免费区| 日本五十路高清| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 变态另类丝袜制服| 夜夜爽天天搞| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久伊人香网站| 黑人欧美特级aaaaaa片| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产高潮美女av| 亚洲精品色激情综合| 99精品欧美一区二区三区四区| www.999成人在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲五月天丁香| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美极品一区二区三区四区| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品国产三级普通话版| 国产精品 国内视频| 在线观看日韩欧美| 观看免费一级毛片| 免费看光身美女| 日本黄大片高清| 村上凉子中文字幕在线| 精品乱码久久久久久99久播| 国产一区二区在线观看日韩 | 可以在线观看毛片的网站| 婷婷六月久久综合丁香| 日本a在线网址| 99热只有精品国产| 好男人电影高清在线观看| 欧美大码av| 亚洲最大成人手机在线| 搡老岳熟女国产| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产美女午夜福利| 中文字幕熟女人妻在线| 午夜a级毛片| 欧美最新免费一区二区三区 | 禁无遮挡网站| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲最大成人中文| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久久色成人| 久久人人精品亚洲av| 亚洲av熟女| 美女黄网站色视频| 国产爱豆传媒在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 99久久成人亚洲精品观看| 香蕉丝袜av| 99在线人妻在线中文字幕| 一进一出好大好爽视频| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 男女之事视频高清在线观看| 精品国产三级普通话版| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国内精品久久久久久久电影| 最近最新中文字幕大全免费视频| 此物有八面人人有两片| 级片在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 真实男女啪啪啪动态图| 久久久久久久精品吃奶| www.色视频.com| 免费在线观看影片大全网站| 欧美高清成人免费视频www| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美zozozo另类| 亚洲,欧美精品.| 九九在线视频观看精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 最近最新中文字幕大全电影3| 91在线观看av| 欧美一区二区精品小视频在线| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 丰满人妻一区二区三区视频av | 国产成人啪精品午夜网站| 精品午夜福利视频在线观看一区| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 国产高清视频在线观看网站| 最近最新中文字幕大全免费视频| aaaaa片日本免费| 级片在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品人妻1区二区| 精品国产美女av久久久久小说| 露出奶头的视频| 在线观看午夜福利视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 99热这里只有是精品50| 欧美最新免费一区二区三区 | 美女高潮的动态| 国产成人av激情在线播放| 内射极品少妇av片p| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲国产精品sss在线观看| 97超视频在线观看视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 一本久久中文字幕| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 丰满的人妻完整版| 亚洲av一区综合| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久久国产成人精品二区| 免费在线观看日本一区| h日本视频在线播放| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲最大成人手机在线| 国产高清videossex| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 99热精品在线国产| 国产高清激情床上av| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲av五月六月丁香网| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 日韩欧美三级三区| netflix在线观看网站| 可以在线观看的亚洲视频| 黄片小视频在线播放| 欧美区成人在线视频| 99热精品在线国产| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 动漫黄色视频在线观看| 久久人妻av系列| 听说在线观看完整版免费高清| 日本五十路高清| 特级一级黄色大片| 国产色爽女视频免费观看| 免费观看精品视频网站| 国产高清videossex| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产高清videossex| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 亚洲精品在线美女| 大型黄色视频在线免费观看| 午夜福利18| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 制服人妻中文乱码| 欧美av亚洲av综合av国产av| 真人一进一出gif抽搐免费| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 日本在线视频免费播放| 日本熟妇午夜| eeuss影院久久| 久久久久久久午夜电影| av女优亚洲男人天堂| 国产在视频线在精品| 岛国在线观看网站| 欧美日韩综合久久久久久 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 给我免费播放毛片高清在线观看| 香蕉丝袜av| 国产精品久久久久久精品电影| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲黑人精品在线| 亚洲自拍偷在线| 欧美日本视频| 中出人妻视频一区二区| 1024手机看黄色片| 国产成人a区在线观看| 69av精品久久久久久| 丁香欧美五月| 精品福利观看| 无人区码免费观看不卡| 麻豆成人午夜福利视频| 最后的刺客免费高清国语| 日韩av在线大香蕉| 九色成人免费人妻av| 99精品欧美一区二区三区四区| 热99在线观看视频| 嫩草影视91久久| av天堂在线播放| 国产成人系列免费观看| 亚洲片人在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 日韩高清综合在线| 成人亚洲精品av一区二区| 久久精品国产综合久久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 欧美日韩福利视频一区二区| 看片在线看免费视频| 成人av一区二区三区在线看| 国产一区二区在线av高清观看| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 在线a可以看的网站| 香蕉av资源在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产高清有码在线观看视频| 国产99白浆流出| 欧美日韩黄片免| 日韩免费av在线播放| 国产三级在线视频| 天天添夜夜摸| 美女cb高潮喷水在线观看| 三级毛片av免费| 高潮久久久久久久久久久不卡| av天堂中文字幕网| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 一级毛片女人18水好多| 真人做人爱边吃奶动态| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲精品在线观看二区| 香蕉av资源在线| 丝袜美腿在线中文| 亚洲成av人片免费观看| 色视频www国产| 麻豆国产av国片精品| 亚洲av第一区精品v没综合| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 日本一本二区三区精品| 动漫黄色视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲在线自拍视频| 身体一侧抽搐| 天堂√8在线中文| 国产成人av教育| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产三级黄色录像| aaaaa片日本免费| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产三级黄色录像| 一级黄片播放器| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 欧美国产日韩亚洲一区| 天天一区二区日本电影三级| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产伦人伦偷精品视频| 99久国产av精品| 内射极品少妇av片p| 日本 av在线| 高清毛片免费观看视频网站| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 免费高清视频大片| 最近在线观看免费完整版| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日韩人妻高清精品专区| 哪里可以看免费的av片| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| eeuss影院久久| 老鸭窝网址在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| av女优亚洲男人天堂| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产不卡一卡二| 国产精品久久视频播放| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精品,欧美在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产乱人视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 特大巨黑吊av在线直播| 天天一区二区日本电影三级| www日本黄色视频网| 免费看十八禁软件| 亚洲在线观看片| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 99久久综合精品五月天人人| 国产极品精品免费视频能看的| 变态另类丝袜制服| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 哪里可以看免费的av片| 操出白浆在线播放| 在线国产一区二区在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品免费久久久久久久清纯| 免费在线观看成人毛片| 久久久久久久久中文| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 一本久久中文字幕| 国产精品野战在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美激情在线99| 国产成人a区在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 丝袜美腿在线中文| 啦啦啦观看免费观看视频高清| av中文乱码字幕在线| 久久亚洲真实| 一级毛片女人18水好多| 成人三级黄色视频| 性色avwww在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 在线视频色国产色| 亚洲精华国产精华精| 国产激情欧美一区二区| 精品久久久久久,| a在线观看视频网站| 成人一区二区视频在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 夜夜爽天天搞| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日韩欧美精品v在线| 桃红色精品国产亚洲av| 18+在线观看网站| 五月伊人婷婷丁香| 成年人黄色毛片网站| 18+在线观看网站| 他把我摸到了高潮在线观看| 日韩有码中文字幕| 国产亚洲精品一区二区www| 香蕉av资源在线| 免费在线观看成人毛片| 欧美最新免费一区二区三区 | 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲精华国产精华精| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产一区在线观看成人免费| 日本一二三区视频观看| 久久久久久久久中文| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 精品福利观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美3d第一页| 99视频精品全部免费 在线| 中文字幕熟女人妻在线| 日本在线视频免费播放| 麻豆久久精品国产亚洲av| 观看美女的网站| 99热这里只有是精品50| 丁香欧美五月| 给我免费播放毛片高清在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 在线播放国产精品三级| 一进一出抽搐gif免费好疼| av视频在线观看入口| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲成人中文字幕在线播放| 1024手机看黄色片| 亚洲欧美日韩东京热| 岛国视频午夜一区免费看| 久久久国产成人精品二区| 熟女电影av网| 乱人视频在线观看| 九色国产91popny在线| 国产真实伦视频高清在线观看 | 99久久精品热视频| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久久精品大字幕| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产黄片美女视频| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美大码av| 亚洲自拍偷在线| 在线观看日韩欧美| 麻豆成人av在线观看| 超碰av人人做人人爽久久 | 久久久久久九九精品二区国产| 日本 欧美在线| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 特大巨黑吊av在线直播| av专区在线播放| 欧美bdsm另类| 免费在线观看成人毛片| 女同久久另类99精品国产91| 性色av乱码一区二区三区2| 天堂网av新在线| avwww免费| 熟女人妻精品中文字幕| 99视频精品全部免费 在线| 精品免费久久久久久久清纯| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美3d第一页| 国产精品综合久久久久久久免费| 性色avwww在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 淫秽高清视频在线观看| av黄色大香蕉| 亚洲欧美日韩无卡精品| 在线观看日韩欧美| 久久香蕉精品热| 俄罗斯特黄特色一大片| 99热这里只有精品一区| 在线播放国产精品三级| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美色视频一区免费| 小说图片视频综合网站| 一个人免费在线观看电影| 一级毛片高清免费大全| 在线免费观看的www视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩欧美免费精品| 欧美三级亚洲精品| 极品教师在线免费播放| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美三级亚洲精品| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 我要搜黄色片| 国产色婷婷99| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲成人久久爱视频| 一级黄色大片毛片| 精品免费久久久久久久清纯| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲精品在线观看二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲专区国产一区二区| 男女视频在线观看网站免费| 国产黄片美女视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲av五月六月丁香网| 免费观看人在逋| 亚洲无线观看免费| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美日本视频| av在线天堂中文字幕| 国产亚洲精品av在线| 国产伦人伦偷精品视频| 黄色丝袜av网址大全| 一区福利在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲电影在线观看av| 91久久精品国产一区二区成人 | 99国产极品粉嫩在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美最黄视频在线播放免费| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 久久久久久久亚洲中文字幕 | 欧美日韩乱码在线| 伊人久久精品亚洲午夜| 中文字幕熟女人妻在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 制服丝袜大香蕉在线| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美zozozo另类| 99久久九九国产精品国产免费| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲色图av天堂| 桃红色精品国产亚洲av| 我的老师免费观看完整版| 亚洲国产色片| 国产精品影院久久| 欧美丝袜亚洲另类 | 成人18禁在线播放| 免费av毛片视频| 久久久精品大字幕| 宅男免费午夜| 真实男女啪啪啪动态图| 国产高清视频在线观看网站| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久精品影院6| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产黄a三级三级三级人| 成人一区二区视频在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| netflix在线观看网站| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 精品久久久久久久毛片微露脸| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产黄色小视频在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美zozozo另类| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲中文字幕日韩| 国产精华一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 欧美日韩黄片免| 午夜精品在线福利| 中文字幕av成人在线电影| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 美女 人体艺术 gogo| 日韩欧美精品v在线| 亚洲不卡免费看| 岛国视频午夜一区免费看| 国产激情欧美一区二区| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 超碰av人人做人人爽久久 | 色吧在线观看| 国内精品久久久久精免费| 麻豆国产97在线/欧美| 国产熟女xx| 日日干狠狠操夜夜爽| 麻豆成人av在线观看| 1024手机看黄色片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 性欧美人与动物交配| 久久这里只有精品中国| 99热这里只有是精品50| 色综合站精品国产| 日韩国内少妇激情av| 免费大片18禁| 黄色日韩在线| 免费观看的影片在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 性欧美人与动物交配| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 亚洲专区中文字幕在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲精品在线观看二区| 国产69精品久久久久777片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 真实男女啪啪啪动态图| 成人特级av手机在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 欧美成人性av电影在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲精品久久国产高清桃花| av在线蜜桃| av片东京热男人的天堂| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲av免费在线观看| 窝窝影院91人妻| 国产精品女同一区二区软件 | 女警被强在线播放| 村上凉子中文字幕在线| 99久久综合精品五月天人人| 国产91精品成人一区二区三区| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 天天一区二区日本电影三级| 一边摸一边抽搐一进一小说| 成年女人看的毛片在线观看| 久久久久性生活片| 久久精品国产自在天天线| 国产成人a区在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美乱妇无乱码| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产在视频线在精品| 国产三级黄色录像| 亚洲色图av天堂| 成人性生交大片免费视频hd| 村上凉子中文字幕在线| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品久久久人人做人人爽| 成人欧美大片| 叶爱在线成人免费视频播放| 99视频精品全部免费 在线| 无人区码免费观看不卡| 一区福利在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 免费观看人在逋|