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    γδT細(xì)胞在急性乙型肝炎病毒感染小鼠模型中的變化分析①

    2014-11-27 11:15:54重慶醫(yī)科大學(xué)病毒性肝炎研究所感染性疾病分子生物學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重慶400010
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2014年1期
    關(guān)鍵詞:脾臟肝細(xì)胞外周血

    常 琳 王 磊 彭 輝 陳 敏 (重慶醫(yī)科大學(xué)病毒性肝炎研究所,感染性疾病分子生物學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400010)

    乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)為一種噬肝病毒,感染后可致乙型肝炎、肝硬化等多種嚴(yán)重肝病,嚴(yán)重威脅生命健康。研究表明,在急性HBV感染過程中,HBV感染肝細(xì)胞后,可激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng),包括激活多種非特異性免疫細(xì)胞及特異性免疫細(xì)胞等,使機(jī)體最終清除HBV,同時(shí)產(chǎn)生HBV特異性的抗體及記憶型免疫細(xì)胞[1-3]。肝臟中自然殺傷細(xì)胞(Nature killer cells,NK)、自然殺傷T細(xì)胞(Nature killer T cells,NKT)及 γδT 細(xì)胞等非特異性免疫細(xì)胞含量豐富,可占全部肝臟淋巴細(xì)胞的三分之二,在抗HBV感染免疫中起到了很重要的作用[4-6]。γδT細(xì)胞是除 NK、NKT外的另一種重要的非特異性免疫細(xì)胞,可在多種細(xì)菌或病毒感染中發(fā)生激活,起到免疫清除或免疫調(diào)節(jié)的作用[7-9]。但目前γδT細(xì)胞在急性HBV感染中的作用還未見相關(guān)報(bào)道。因此本文擬通過尾靜脈高壓水動(dòng)力法注射HBV質(zhì)粒構(gòu)建急性乙型肝炎病毒感染小鼠模型,直接分析肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞的變化,并與外周血及脾臟中的γδT細(xì)胞比較,從而初步探討γδT細(xì)胞在HBV急性感染清除機(jī)制中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 質(zhì)粒 含HBV全基因組(ayw亞型)1.3倍體真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-HBV1.3)及空載體pcDNA3.1均為本所(重慶醫(yī)科大學(xué)病毒性肝炎研究所)保存。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)(SPF)雌性C57BL/6J小鼠45只,4~6周齡,體重(16~20)g,購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將鼠隨機(jī)分為9組,每組各5只,包括正常對(duì)照組(NC)、pcDNA3.1-HBV1.3質(zhì)粒1天(pHBV1d)、5 天(pHBV5d)、10 天(pHBV10d)、15天(pHBV15d)、pcDNA3.1質(zhì)粒1天(pcDNA1d)、3天(pcDNA3d)、5 天(pcDNA5d)、7 天(pcDNA7d)。小鼠在該中心清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng),動(dòng)物房保持通風(fēng)、干燥、室溫(22~25)℃,濕度(50~70)%,自由飲水,鼠料定量飼養(yǎng)。

    1.1.3 試劑 Anti-Mouse CD16/CD32 Purified(14-0161-81,eBioscience),PerCP Hamster Anti-Mouse CD3e(553067,BD Parmingen),PE Hamster Anti-Mouse γδ T-cell receptor(553178,BD Parmingen),PE-Cy5TMAnti-Mouse CD69(15-0691-81,eBioscience),APC Rat anti-mouse CD25(558643,BD Parmingen),F(xiàn)ITC Hamster anti-mouse γδ T-cell receptor(553177,BD Parmingen),PE anti-mouse IFN-gamma(12-7311-81,eBioscience),PE-Cy7TMRat anti-mouse TNF(557644,BD Parmingen),膠原酶Ⅳ(C5138,sigma),DNA 酶Ⅰ(D5025,sigma),percoll(17-0891-01,Pharmacia)。免疫組化檢測(cè)試劑:購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,包括mouse anti-HBsAg(ZM-0421),mouse anti-HBcAg(ZM-0122),polymer detection system(PV-6000)等。

    1.1.4 設(shè)備 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf,centrifuge 5810R),流式細(xì)胞儀(美國(guó) BD,BD FACSCantoTMⅡ)。

    1.2 方法

    1.2.1 急性乙型肝炎病毒(HBV)感染小鼠模型復(fù)制 采用尾靜脈高壓水動(dòng)力注射方法[10]。pcDNA 3.1-HBV1.3或 pcDNA3.1質(zhì)粒約40 μg溶于1.5 ml PBS中,將鼠尾置于60℃溫水中數(shù)秒,以0.4 ml/s的速度將質(zhì)粒溶液注入小鼠尾靜脈。于注射后各時(shí)間點(diǎn),摘眼球取血,分離血清,檢測(cè)血清中HBsAg、HBeAg、ALT及 TB。以此來確定模型是否構(gòu)建成功。

    1.2.2 血清HBsAg、HBeAg及ALT、TBiL的檢測(cè)均送往重慶醫(yī)科大學(xué)附二院檢測(cè)。血清HBsAg、HBeAg用羅氏電化學(xué)發(fā)光法分析,結(jié)果用COI(cutoff index)表示,>1 COI為陽性。肝功能(ALT、TBiL)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

    1.2.3 小鼠肝臟組織HBsAg及HBcAg的檢測(cè) 用酶免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝臟組織石蠟切片中HB-sAg及HBcAg的表達(dá)。收集正常對(duì)照小鼠、pHBV組小鼠的右葉肝臟,固定于10%的中性甲醛液中,直接送于重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室進(jìn)行石蠟切片。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟2次,逐級(jí)酒精水化,3%雙氧水去非特異性染色,抗原修復(fù),5%山羊血清封閉后,加HBsAb或HBcAb 4℃過夜,加聚合物,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,分化脫色,最后脫水、透明及封片,鏡檢。計(jì)數(shù)每高倍視野下(×400倍)陽性著色(棕色)的肝細(xì)胞數(shù),并計(jì)算陽性率。

    1.2.4 肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞的分離 用乙醚麻醉小鼠,用PBS經(jīng)肝門靜脈灌注去肝內(nèi)殘留血液,剪下肝臟并用PBS清洗后剪碎,加入10 ml消化液(含0.05%膠原酶Ⅳ及0.01%DNA酶Ⅰ的 RPMI1640液),37℃水浴消化30 min,期間不停用吸管吹打,然后經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后,500 r/min離心去沉淀(含肝細(xì)胞等),再1 800 r/min離心收集沉淀細(xì)胞(含淋巴細(xì)胞等),經(jīng)33%percoll液2 500 r/min密度梯度離心后,去掉所有上層液體,留沉淀細(xì)胞,加入0.75%NH4Cl溶解紅細(xì)胞,再經(jīng)FACS buffer(含1%胎牛血清的PBS)洗滌后,即得肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞。

    1.2.5 脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞的分離 用兩張玻片相互擠壓磨碎脾臟,經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后,1 800 r/min離心收集沉淀細(xì)胞(含淋巴細(xì)胞等),加入0.75%NH4Cl溶解紅細(xì)胞,再經(jīng)FACS buffer洗滌后,即得脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞。

    1.2.6 肝或脾內(nèi)γδT細(xì)胞染色及流式檢測(cè) 取肝或脾淋巴細(xì)胞2×105,加入CD16/32抗體4℃封閉10 min,再按說明書加入適量的熒光標(biāo)記抗體anti-CD3e、anti-γδ T-cell receptor、anti-CD69 或 anti-CD25,4℃孵育30 min,用 FACS buffer洗滌后,吸入專用的流式上樣管,用FACS CantoⅡ(BD Biosciences)流式儀檢測(cè),再用BD FACSDivaTMsoftware分析軟件進(jìn)行流式數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)分析得到 γδT細(xì)胞、CD25+γδT 或 CD69+γδT 的比例。

    1.2.7 外周血γδT細(xì)胞的檢測(cè) 小鼠摘眼球取外周靜脈血,用肝素抗凝。取抗凝血100 μl,加入CD16/32抗體4℃封閉10 min,再加入適量的熒光抗體 anti-CD3e、anti-γδ T-cell receptor、anti-CD69 或anti-CD25,4℃孵育 30 min 后,加 2 ml 1∶10 稀釋的紅細(xì)胞裂解液(FACSTMlysing solution,BD)混勻,室溫避光作用10 min,離心后,用FACS buffer洗滌,立即流式檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析,得到γδT細(xì)胞、CD25+γδT或CD69+γδT的比例。

    1.2.8 γδT細(xì)胞的胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè) 肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640的完全培養(yǎng)基中,加入終濃度為100 ng/ml佛波脂(PMA)、1 μg/ml離子霉素及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(0.16 μg/ml莫能霉素),將細(xì)胞置于24孔板內(nèi),37℃ 5%CO2孵箱內(nèi)作用4 h。細(xì)胞體外刺激后,用FACS buffer洗1次,加入CD16/32抗體4℃封閉10 min,用anti-TCR γδ mAb做表面染色,洗滌后,用4%多聚甲醛固定,經(jīng)0.1%saponin透膜后,加入相應(yīng)體積的 anti-IFN-γ及 anti-TNF-α流式抗體做胞內(nèi)染色,4℃避光染色30 min,洗滌后,加200 μl的 FACS buffer重懸,于BD FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè),并用BD FACSDiva 2.0軟件分析數(shù)據(jù),獲得IFN-γ+γδT 及 TNF-α+γδT 細(xì)胞的比例。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用PASW Statistics18.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件作多組間均數(shù)的方差分析(F檢驗(yàn)),兩樣本均數(shù)間比較用q檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 急性HBV感染小鼠模型復(fù)制 小鼠對(duì)尾靜脈高壓水動(dòng)力注射法耐受良好,除極個(gè)別在注射后立即發(fā)生心衰死亡外,其余均能迅速恢復(fù)正常飲食與飲水,肝臟也未發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)節(jié)或壞死。注入HBV質(zhì)粒后,血清中的HBsAg在第1天(pHBV1d)即為陽性(33.64±14.88)COI(>1 COI),在第5天(pHBV5d)達(dá)高峰(146.92±24.23)COI,隨即降低,到第15天(pHBV15d)仍為陽性(圖1A);血清HBeAg水平在第1天即達(dá)高峰(2.26±2.34)COI,為陽性,并隨著時(shí)間的推移迅速降低,第10天(pHBV10d)為陰性(<1 COI,圖1B)。同時(shí),HBV質(zhì)粒小鼠血清中的ALT水平在第1天上升至300U/L,隨后迅速下降至正常,而TBiL水平一直保持正常,未見升高。正常對(duì)照小鼠與pcDNA對(duì)照質(zhì)粒小鼠的外周血中HBV標(biāo)志物一直為陰性。pcDNA質(zhì)粒注射第一天小鼠的ALT水平升至80 U/L,隨即降低到正常水平。

    同時(shí)用免疫組化法檢測(cè)了pHBV1d、pHBV5d及正常對(duì)照(NC)小鼠肝臟組織內(nèi)HBsAg與HBcAg的表達(dá),見圖2。圖中顯示,pHBV1d小鼠中表達(dá)HB-sAg或HBcAg的肝細(xì)胞達(dá)10% ~20%左右,HBsAg陽性細(xì)胞數(shù)高于HBcAg陽性細(xì)胞數(shù)。而pHBV5 d小鼠表達(dá)HBsAg或HBcAg的肝細(xì)胞迅速降低,僅有1%~3%左右,HBsAg主要表達(dá)于胞漿,而HB-cAg胞漿胞核均有表達(dá)。

    圖1 HBV質(zhì)粒(pHBV)急性轉(zhuǎn)染小鼠模型血清中HBsAg(A)及HBeAg(B)的時(shí)間變化曲線(>1 COI為陽性)Fig.1 The time variation curve of HBsAg(A)or HBeAg(B)in the serum of mice hydrodynamic injected with pcDNA3.1-HBV1.3 plasmid(positive when higher than 1 COI)

    圖2 正常對(duì)照小鼠(NC)、HBV質(zhì)粒注射1天(pHBV1d)與5天(pHBV5d)小鼠的肝臟組織內(nèi)HBsAg與HB-cAg的表達(dá)(DAB顯色,×200倍)Fig.2 The HBsAg or HBcAg expression in liver tissue from NC,pHBV1d,or pHBV5d mouse by immunohistochemistry staining(×200 multiple)

    圖3 小鼠肝臟、脾臟及外周血中γδT細(xì)胞的流式檢測(cè)圖(圖中比例表示γδT細(xì)胞占T細(xì)胞中的比例)Fig.3 The FACS figures of γδT cells in murine liver,spleen or blood(the values in the figure represent the proportion of γδT cells in T cells)

    2.2 急性HBV感染小鼠模型中肝臟、脾臟及外周血γδT細(xì)胞比例的變化 用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)了小鼠肝臟、脾臟及外周血中γδT細(xì)胞占T細(xì)胞中的比例(圖3),結(jié)果顯示正常對(duì)照小鼠(NC)肝臟中的γδT細(xì)胞比例(4.5±0.6)%明顯高于脾臟(2.1±0.3)%或外周血(1.2±0.6)%,差異有顯著性(P<0.01)。在HBV質(zhì)粒(pHBV)急性轉(zhuǎn)染小鼠后的第1天(pHBV1d),肝臟內(nèi)的γδT細(xì)胞的比例即刻升高至(8.3±4.3)%,然后隨時(shí)間的推移而逐漸降低,但到第10天時(shí),γδT細(xì)胞的比例又快速升高至(8.0±1.2)%,而后又下降。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,pHBV1d小鼠肝臟內(nèi)的γδT細(xì)胞比例明顯高于NC、pHBV5d、pHBV15d天的比例,差異有顯著性(P<0.05)。但各時(shí)間點(diǎn)脾臟或外周血中的γδT細(xì)胞比例未見有明顯的變化,組間的差異無顯著性(P>0.05,圖4)。在 pcDNA3.1對(duì)照質(zhì)粒注射后,小鼠肝臟、脾臟或外周血中的γδT細(xì)胞比例均未見有顯著性的變化發(fā)生(P>0.05,圖5)。

    圖4 水動(dòng)力法注射小鼠HBV質(zhì)粒(pHBV)后肝臟、脾臟及外周血中γδT細(xì)胞比例變化的時(shí)間曲線Fig.4 Time variation curve of the proportion of γδT cells in the liver,spleen or peripheral blood of mice with hydrodynamic injection of pcDNA3.1-HBV1.3 plasmid

    圖5 pcDNA3.1質(zhì)粒注射小鼠后肝臟、脾臟及外周血中γδT細(xì)胞比例的時(shí)間變化曲線Fig.5 Change in the proportion of γδT cells in the liver,spleen or peripheral blood of mice injected with pcDNA3.1 plasmid

    圖6 小鼠肝臟內(nèi)表達(dá)CD25+或CD69+的γδT細(xì)胞流式檢測(cè)圖(圖中比例表示CD25+或CD69+γδT細(xì)胞占γδT細(xì)胞中的比例)Fig.6 FACS figure of CD25+or CD69+ γδT cells in murine liver(the values in the figure represent the proportion of CD25+or CD69+ γδT cells in γδT cells)

    2.3 肝臟中γδT細(xì)胞的激活表型在急性HBV感染小鼠模型中的變化 檢測(cè)了正常對(duì)照小鼠(NC)及HBV 質(zhì)粒注射小鼠(pHBV)后第1、5、10、15天肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞的激活表型分子CD25與CD69(流式檢測(cè)圖見圖6)。CD69陽性的γδT細(xì)胞比例在NC肝臟中為(9.9±2.7)%,而在pHBV小鼠中CD69+γδT細(xì)胞比例隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低,到第15天比例又逐漸回升。而肝臟內(nèi)CD25+γδT細(xì)胞比例在pHBV質(zhì)粒注射后第5天達(dá)到最高值(8.4±3.7)%,與血清中HBsAg水平達(dá)高峰時(shí)間一致,然后比例隨著時(shí)間而降低(圖7)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,pHBV模型組小鼠第10天的CD69+γδT細(xì)胞比例與其他組比較差異有顯著性(P<0.05),而各時(shí)間點(diǎn)下表達(dá)CD25分子γδT細(xì)胞的比例差異無顯著性,P>0.05。

    圖7 肝臟內(nèi)CD25或CD69陽性的γδT細(xì)胞比例在急性HBV質(zhì)粒(pHBV)轉(zhuǎn)染小鼠模型中的變化Fig.7 Change in the proportion of CD25 or CD69 positive γδT cells in the liver of mice injected with HBV plasmid

    圖8 小鼠肝臟內(nèi)產(chǎn)生IFN-γ或TNF-α的γδT細(xì)胞流式檢測(cè)圖(圖中比例表示 IFN-γ+或 TNF-α+γδT細(xì)胞占γδT細(xì)胞中的比例)Fig.8 FACS figures of IFN-γ+or TNF-α+ γδT cells in murine liver(the values in the figure represent the proportion of IFN-γ+or TNF-α+γδT cells in γδT cells)

    圖9 肝臟內(nèi)IFN-γ或TNF-α陽性的γδT細(xì)胞比例在急性HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠模型中的變化Fig.9 Change in the proportion of IFN-γ or TNF-α positive γδT cells in the liver of mice injected with HBV plasmid

    2.4 肝臟內(nèi)產(chǎn)生 IFN-γ或TNF-α細(xì)胞因子的γδT細(xì)胞比例在急性HBV感染小鼠模型中的變化 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了正常對(duì)照小鼠(NC)、pHBV模型小鼠1、5、10 d 肝臟內(nèi) IFN-γ+或 TNF-α+γδT 細(xì)胞比例(流式檢測(cè)圖見圖8)。pHBV質(zhì)粒尾靜脈注射后第1天產(chǎn)生的 IFN-γ的 γδT細(xì)胞比例升高至(8.6±3.2)%,之后即刻降低至正常對(duì)照水平。而TNF-α陽性的γδT細(xì)胞比例隨著時(shí)間而緩慢上升(圖9)。統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果顯示,pHBV1天的IFN-γ+或TNF-α+γδT細(xì)胞比例與其他時(shí)間點(diǎn)比較,差異無顯著性(P>0.05)。

    3 討論

    HBV病毒主要感染肝細(xì)胞,肝臟內(nèi)富含淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞,它們與抗HBV免疫及肝細(xì)胞免疫炎癥密切相關(guān)。其中非特異性免疫細(xì)胞包括NK、NKT及γδT細(xì)胞總量可占肝臟淋巴細(xì)胞的一半以上,因此在與HBV感染相關(guān)的免疫機(jī)制中非常重要[4-6]。

    γδT細(xì)胞是一類除NK、NKT等細(xì)胞外的天然免疫細(xì)胞,參與了多種細(xì)菌與病毒的免疫應(yīng)答[7-9]。Ajuebor等[11]的報(bào)道顯示,在由腺病毒引起的小鼠肝臟炎性損傷過程中,γδT細(xì)胞是肝細(xì)胞免疫損傷的關(guān)鍵因素。Barcy等[12]也發(fā)現(xiàn),在慢性人皰疹病毒8型感染中,γδT細(xì)胞的比例及功能均增強(qiáng)。Tseng等[13]研究γδT細(xì)胞與慢性丙型肝炎的關(guān)系中發(fā)現(xiàn),患者肝組織的γδT細(xì)胞比例增加,功能增強(qiáng),與肝組織的免疫病理密切相關(guān)。而目前有關(guān)γδT細(xì)胞在HBV感染中的作用還不怎么清楚,我們?cè)谇捌诘难芯恐兄饕^察了HBV感染患者外周血中γδT細(xì)胞比例與表型的變化[14],因此本文以急性HBV感染小鼠作模型,著重觀察肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞的比例、激活表型及細(xì)胞因子表達(dá)的變化,以期了解γδT細(xì)胞在HBV感染免疫反應(yīng)中的作用。

    由于目前HBV自然感染模型僅限于黑猩猩等靈長(zhǎng)類動(dòng)物,而無法在普通實(shí)驗(yàn)室復(fù)制。因此我們參照Yang等[10]方法,利用尾靜脈高壓水動(dòng)力注射原理,直接將HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠肝臟,可使HBV質(zhì)粒在肝細(xì)胞中復(fù)制與抗原表達(dá),從而模擬機(jī)體的HBV急性感染清除的過程。我們?cè)贖BV質(zhì)粒注射后的不同時(shí)間檢測(cè)了HBsAg或HBeAg在血清中的水平,結(jié)果顯示,HBsAg可在肝細(xì)胞中高效表達(dá)并分泌至血液中,第1天即為陽性,并在第五天達(dá)高峰,而HBeAg在第1天為陽性,隨之下降,并維持于0.5 COI~0.9 COI之間。而對(duì)照pcDNA3.1質(zhì)粒注射后,HBsAg(0.733±0.366 COI)與 HBeAg(0.091±0.017 COI)均為陰性。同時(shí)我們用免疫組化法檢測(cè)了HBV質(zhì)粒小鼠肝組織內(nèi)HBsAg與HB-cAg的表達(dá),發(fā)現(xiàn)第1天小鼠肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)最強(qiáng)(陽性率為10% ~20%左右),而到第5天降低至僅有1% ~3%左右。結(jié)果顯示,肝細(xì)胞內(nèi)HBV抗原消失時(shí)間早于血清中的,這與HBV抗原具有一定半衰期有關(guān)。結(jié)果也證明,經(jīng)水動(dòng)力法注射HBV質(zhì)粒,可使HBV在肝細(xì)胞內(nèi)得以感染與抗原表達(dá)。因此,小鼠急性HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染清除模型構(gòu)建成功。但Yang[10]的結(jié)果顯示,HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后第1天 HB-sAg及HBeAg水平均達(dá)高峰,隨后降低,而我們的模型中HBsAg水平在第5天才達(dá)高峰,可能與所選的小鼠品系及質(zhì)粒載體有關(guān)系。

    首先,我們觀察了模型肝臟、脾臟及外周血內(nèi)γδT細(xì)胞的比例在HBV質(zhì)粒注射后的不同時(shí)間下的變化,結(jié)果顯示,在HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后第1天,肝臟內(nèi)的γδT細(xì)胞比例立即升高,而脾中的比例降低,外周血中的比例略升高。之后,γδT細(xì)胞比例降低,而到第10天,比例又升高。結(jié)果提示在注射后第1天,由于HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入肝細(xì)胞內(nèi),肝細(xì)胞瞬間表達(dá)大量的HBV抗原,并且由于尾靜脈高壓注射引起肝細(xì)胞膜暫時(shí)性通透性增加,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞,因此可引起大量免疫細(xì)胞向肝臟的聚集。由于γδT細(xì)胞作為一種非特異性免疫細(xì)胞,具有在短時(shí)間內(nèi)迅速遷移至機(jī)體損傷部位而發(fā)生炎癥或修復(fù)反應(yīng)的特性,因此,在HBV質(zhì)粒注射后第1天,γδT細(xì)胞即可反應(yīng)性地從脾臟或血中向肝臟內(nèi)聚集,從而導(dǎo)致肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞比例的增高。而后,其他免疫細(xì)胞在肝臟內(nèi)逐漸增多,且γδT細(xì)胞在免疫反應(yīng)過程中有一定的損傷與消耗,而使比例降低,隨著時(shí)間推移,γδT細(xì)胞可發(fā)生一定的增殖或遷移性補(bǔ)充而使比例再次升高。而脾臟或外周血中的γδT細(xì)胞比例未發(fā)生顯著性的變化。同時(shí),我們課題組的其他成員還檢測(cè)了HBV質(zhì)粒小鼠肝臟中NK、CD4+T及CD8+T細(xì)胞比例的變化。發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞(占肝淋巴細(xì)胞比例)也是在第1天較正常小鼠(17.8±5.4)%急劇升高,為(33.7±4.1)%,隨后迅速下降,第10天降至正常小鼠水平。而肝內(nèi)CD4+T或CD8+T細(xì)胞比例(占肝T細(xì)胞比例)至第5天才分別下降或上升到最高水平。結(jié)果顯示,NK或γδT等非特異性免疫細(xì)胞可對(duì)外來抗原迅速作出反應(yīng),是參與機(jī)體免疫反應(yīng)的第一線。

    接著,我們又觀察了肝臟內(nèi)γδT細(xì)胞激活分子CD69及CD25的表達(dá),以及產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ或TNF-α的情況。結(jié)果顯示,CD69分子的表達(dá)在前10天呈下降,而在第15天,表達(dá)又增高;相反,CD25+γδT比例在第5天升高至高峰,與HBsAg在血清中的高峰時(shí)間一致,而后又降低。兩種激活分子的表達(dá)呈現(xiàn)了相反的變化規(guī)律。結(jié)果提示,可能肝內(nèi)已存在的CD69+γδT細(xì)胞因被消耗而使比例降低,但CD25分子卻為HBV感染后激活γδT細(xì)胞而產(chǎn)生,因此,γδT細(xì)胞的CD25激活分子的表達(dá)增加。而γδT細(xì)胞在激活狀態(tài)可分泌TNF-α或IFN-γ等多種細(xì)胞因子,與多篇文獻(xiàn)報(bào)道一致。

    因此,本文初步提示了,γδT細(xì)胞在急性HBV感染小鼠模型中早期即可比例升高,接著出現(xiàn)激活分子增加,細(xì)胞因子產(chǎn)生增強(qiáng)的過程,結(jié)果揭示了γδT細(xì)胞可能參與了HBV急性感染與清除的過程。

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