As2O3預(yù)處理對離體缺血再灌注心肌的保護(hù)作用及機(jī)制

王方巖，戴雍月，方周溪，郝卯林，汪 洋

(1溫州醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，浙江溫州325000;2溫州醫(yī)學(xué)院電鏡室)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)常見于冠脈狹窄再通、心臟移植及冠脈搭橋術(shù)等外科手術(shù)過程中。對MIRI切實有效的保護(hù)方法至今仍為研究熱點［1，2］。2011年，我們觀察了三氧化二砷(As2O3)預(yù)處理對缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用并探討其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 16只雄性SD大鼠(200～250 g)由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，均自由覓食、覓水;As2O3(哈爾濱伊達(dá)藥業(yè))，熱休克蛋白27 (HSP27)多克隆抗體(武漢博士德)，即用型二步法試劑盒(北京中杉)。Langendorff裝置(ML870B2，AD Instruments，Australia);Powerlab生物信號數(shù)據(jù)記錄及分析系統(tǒng)(AD Instruments，Australia)。其余試劑均購于溫州金山化學(xué)試劑儀器公司。

1.2 離體心臟缺血再灌注模型建立 以水合氯醛麻醉大鼠，肝素1 000 U/kg下腔靜脈注射后迅速開胸取心，接Langendorff裝置逆行灌注，采用恒壓恒溫灌流，灌注壓力100 mmHg，灌注溫度37℃。K-H液成分如下(單位:g/L):NaCl 6.896、KCl 0.350、KH2PO40.163、MgSO4·7H2O 0.296、NaHCO32.100、CaCl20.278、Glucose 1.982，pH 7.4。灌注液95%O2+5% CO2飽和。左心耳根部剪一小口，經(jīng)左心房、房室瓣置入一連接壓力傳感器的乳膠球囊，與Powerlab生物信號數(shù)據(jù)記錄及分析系統(tǒng)連接。調(diào)整球囊大小使左心室舒張末期壓力(LVEDP)初始值為4～10 mm-Hg。將SD大鼠隨機(jī)分為兩組，每組8只。對照組灌注生理鹽水，觀察組實驗前24 h腹腔注射As2O35 mg/kg。離體灌流時，先平衡20 min，再結(jié)扎冠狀動脈左前降支缺血20 min后，松開復(fù)灌60 min。

1.3 觀察項目

1.3.1 心功能及血流動力學(xué)指標(biāo) 結(jié)扎前、缺血20 min、再灌注后30、60 min測定左心室壓力收縮速率(LV+dP/dtmax)、左心室壓力舒張速率(LV-dP/ dtmax)及左室發(fā)展壓(LVDP)。

1.3.2 心肌梗死面積 復(fù)灌結(jié)束行常規(guī)伊文斯藍(lán)、氯化三苯基四氯唑染色，并用Image J圖像分析軟件計算梗死區(qū)心肌面積占危險區(qū)面積(紅色+灰白色)的百分比，得出梗死面積。

1.3.3 心肌組織超微結(jié)構(gòu) 取左心室前壁0.1 cm ×0.1 cm×0.1 cm的組織2～3塊，常規(guī)電鏡標(biāo)本固定脫水后超薄切片，醋酸硝酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察。

1.3.4 心肌組織HSP27表達(dá) 采用二步法，按說明書操作。鏡檢顯色呈棕黃色為陽性表達(dá)。應(yīng)用Image-Pro Plus 4.1專業(yè)圖像分析軟件測量平均吸光度值(A值)作為相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以s表示，單因素方差進(jìn)行分析，重復(fù)測量資料應(yīng)用方差成分的混合模型進(jìn)行統(tǒng)計分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心臟功能 兩組不同時間點LVDP、LV+dP/ dtmax、LV-dP/dtmax比較見表1。

表1 兩組缺血再灌注各時點心功能指標(biāo)變化(n=8，%，s)

表1 兩組缺血再灌注各時點心功能指標(biāo)變化(n=8，%，s)

注:與對照組同時點比較，*P＜0.05，△P＜0.01

組別LV+dP/dtmax LV-dP/dtmax LVDP觀察組缺血20 min 79.94±8.97 76.78±8.63*60.14±1.82△再灌注30 min 80.09±11.51△79.19±10.59△73.07±7.03△再灌注60 min 75.96±13.62△71.77±10.56*68.84±4.68△對照組缺血20 min 73.94±9.82 67.44±8.51 50.88±3.64再灌注30 min 61.61±9.87 61.46±8.54 65.37±2.54再灌注60 min 55.85±7.58 61.33±6.95 57.20±5.07

2.2 心肌梗死面積及HSP27表達(dá) 見表2。

表2 兩組心肌梗死面積和HSP27表達(dá)變化(n=8，s)

表2 兩組心肌梗死面積和HSP27表達(dá)變化(n=8，s)

注:與對照組比較，*P＜0.01

組別 梗死面積(%) HSP27表達(dá)(A值)觀察組 29.16±8.34* 0.393±0.05*對照組52.61±13.25 0.176±0.01

2.3 心肌超微結(jié)構(gòu)變化 電鏡下可見對照組心肌纖維的聚集排列不規(guī)則甚至溶解，線粒體出現(xiàn)顯著腫脹(圖1A)，觀察組上述損傷現(xiàn)象明顯輕于對照組(圖1B)。

圖1 兩組心肌超微結(jié)構(gòu)變化

3 討論

毒物興奮效應(yīng)(Hormesis)是指毒物低于抑制濃度時對機(jī)體產(chǎn)生的刺激作用，是毒理學(xué)用來描述毒性因子(刺激)的雙相劑量效應(yīng)的一個術(shù)語。即高劑量致毒因素(包括毒物、輻射、熱、機(jī)械刺激等)對生物體有害，而低劑量致毒因素對生物體有益。實際上，經(jīng)典的缺血預(yù)處理(IPC)屬于一種利用毒物刺激效應(yīng)激發(fā)機(jī)體保護(hù)作用的手段［3］。

HSP是在從細(xì)菌到哺乳動物中廣泛存在一類熱應(yīng)急蛋白質(zhì)，具有高度保守性，當(dāng)生物細(xì)胞在受到刺激時產(chǎn)生的一類特殊蛋白質(zhì)，具有生物活性和免疫協(xié)同功能，可保護(hù)機(jī)體或細(xì)胞不受或少受傷害，對維持機(jī)體自身的穩(wěn)定性起著重要作用。目前，對HSP的研究涉及多個領(lǐng)域，其中包括IR機(jī)制及防治方面。HSP27屬于小分子HSP家族又名HSPB1，熱休克、氧化應(yīng)激及缺血、缺氧等均可誘導(dǎo)其表達(dá)，靜息狀態(tài)下，細(xì)胞中該蛋白幾乎不表達(dá)或表達(dá)程度很低［4］。已有研究表明其參與心肌對IR［5］、嚴(yán)重缺氧［6］的耐受力機(jī)制。在異氟醚預(yù)處理的研究中發(fā)現(xiàn)HSP27增加通過抗氧化、分子伴侶等多方面發(fā)揮拮抗MIRI作用［7］。龐斯斯等［8］發(fā)現(xiàn)HSP27激活蛋白激酶B是其發(fā)揮心肌保護(hù)作用的重要途徑。As2O3雖被視為劇毒物質(zhì)，但千年前就已被古人應(yīng)用于臨床治療各種疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也將其用于腫瘤的治療。楊萍等［9］在人胚肺成纖維細(xì)胞上觀察了亞砷酸鈉刺激的劑量效應(yīng)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)小劑量確實能夠提高細(xì)胞的增殖及抗氧化能力。本研究采用As2O3小劑量預(yù)處理發(fā)現(xiàn)其對MIRI有拮抗作用［2］。即對缺血再灌注心肌損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能為增加HSP27的表達(dá)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

［1］李洪亮，程齊來，曾靖，等.染料木素對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(40):38-39.

［2］邱玲玲，汪萍，劉樂，等.三氧化二砷預(yù)處理在離體心肌缺血-再灌注損傷中保護(hù)作用的初探［J］.中國微循環(huán)，2009，13(6): 475-477.

［3］Mattson MP.Hormesis defined［J］.Ageing Res Rev，2008，7(1): 1-7.

［4］Yan LJ，Christians ES，Liu L，et al.Mouse heat shock t ranscription factor 1 deficiency alters cardiac redox homeostasis and increases mitochondrial oxidative damage［J］.EMBO J，2002，21(19): 5162-5172.

［5］Pantos C，Mourouzis I，Dimopoulos A，et al.Enhanced tolerance of the rat myocardium to ischemia and reperfusion injury early after acute myocardial infarction［J］.Basic Res Cardiol，2007，102(4): 327-333.

［6］Martin JL，Mestril R，Hilal-Dandan R，et al.Small heat shock proteins and protection against ischemic injury in cardiac myocytes［J］.Circulation，1997，96(12):4343-4348.

［7］秦文艷，劉保江，田首元，等.異氟醚對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6 (6):667-669.

［8］龐斯斯，張小進(jìn)，姜蘇蓉，等.Akt參與熱休克蛋白27保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞過氧化損傷［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008，28(5):613-617.

［9］楊萍，劉起展，李愛萍，等.亞砷酸鈉所致人胚肺成纖維細(xì)胞增殖興奮效應(yīng)與氧化應(yīng)激的關(guān)系［J］.中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2006，(2):103-105.