電針對膝骨關節(jié)炎MIA模型大鼠滑膜組織中MMP－3/TIMP－1表達的影響*

劉苗苗，韋 芳，潘超安，楊 洋，徐斯偉，周俊梅，張必萌△

(1.上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院，上海201620;2.上海市松江樂都醫(yī)院，上海201620)

膝骨關節(jié)炎(Knee Osteoarthritis)是目前世界上最常見的關節(jié)退行性病變，每年都會影響百萬人的生活質量。這種疾病不僅影響了近10%的老年人的生活，同時也使得很多年輕人飽受其害［1］。目前的研究表明膝骨關節(jié)炎是多種因素引起的關節(jié)軟骨退行性病變［2］，主要病理變化為關節(jié)腔變窄、透明軟骨缺失、軟骨下硬化、關節(jié)邊緣骨贅增生等。也有研究發(fā)現(xiàn)膝骨關節(jié)炎的主要病理變化為滑膜纖維化以及關節(jié)腔液成分的改變［3］。盡管膝骨關節(jié)炎發(fā)生的具體機制還不明確，但是可以肯定的是引起此病變的機制不止一種，越來越多的證據(jù)表明滑膜病變在膝骨關節(jié)炎的病理進程中有重要地位［4］。膝骨關節(jié)炎在臨床上的主要表現(xiàn)為關節(jié)的疼痛、腫脹、僵硬以及活動受限，嚴重影響患者的生活質量［5－6］。膝骨關節(jié)炎的治療主要集中在相關癥狀的改善上，目前臨床上常用的非甾體抗炎藥，長期服用可產(chǎn)生不同程度的胃腸道不適等副作用［7］，因此尋求一種安全有效的療法一直是國內外醫(yī)學界所關注的重點，近年來的資料顯示:針灸療法是治療膝骨關節(jié)炎有效方式之一［6－8］。研究表明:針灸在緩解患者膝關節(jié)炎引起的疼痛、腫脹等方面有顯著療效，但對其起效的具體機制尚未明確［9］。

本實驗旨在通過建立動物實驗模型，觀察電針治療膝骨關節(jié)炎MIA模型大鼠過程中滑膜組織中的基質金屬蛋白酶－3(MMP－3)和基質金屬蛋白酶抑制劑－1(TIMP－1)表達的變化，研究電針對MMP－3和TIMP－1的調控機制，為電針治療膝骨關節(jié)炎的可能作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

由上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院動物實驗中心提供的清潔級健康3月齡SD雄性大鼠40只，體重在(280±20)g。實驗動物由本醫(yī)院實驗動物中心負責飼養(yǎng)。實驗過程中對動物的處置符合科學技術部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》［10］以及上海交通大學倫理委員會對于善待動物的相關規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

一次性 1.5寸華佗牌無菌針灸毫針 0.35×40 mm，蘇食藥監(jiān)械(準)字2008第227 0626號，中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;華佗牌電子針療儀SDZII型，蘇食藥監(jiān)械(準)字2009第2270366號，中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;塞來昔布膠囊(商品名:西樂葆，國藥準字J20080059+H20110474):美國輝瑞制藥有限公司;碘乙酸鈉(MIA):Sigma，美國;Trizol試劑:Sigma，美國;兔抗 MMP－3、TIMP－1多克隆抗體:上海浩朗生物科技有限公司;數(shù)碼相機:尼康，日本。其它涉及的試劑及儀器均由上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院實驗中心提供。

2 實驗方法

2.1 設計

隨機對照動物實驗。

2.2 實驗分組

將40只雄性大鼠稱重后按隨機數(shù)字表法隨機分成4組，即正常組、模型組、藥物組和電針組，每組各10只。

2.3 建立動物模型

將SD大鼠置于清潔級環(huán)境中，每2只一籠，采用Guingamp C的經(jīng)典MIA造模方法制備大鼠膝骨關節(jié)炎 MIA 模型［11］，將0.3 mg單體碘乙酸鈉(MIA)溶液注入大鼠左側膝骨關節(jié)腔內，并配合持續(xù)的抽屜樣關節(jié)運動。具體操作步驟為:將3 mg MIA溶入到50 μl 9%的生理鹽水中，清理關節(jié)附近的鼠毛，將關節(jié)屈曲到最大限度后于左膝關節(jié)腔注入配置好的溶液，于右膝處注入同等劑量的生理鹽水，正常組用同樣的方法于兩膝注入50 μl 9%生理鹽水。40只老鼠每天同時做相同的驅趕運動約30 min。

2.4 干預

實驗兩周后，分別對各組進行干預。正常組:給予正常飲食，其它不作特殊處理。造模組:造模后給予正常飲食，不作任何治療。電針組:穴位常規(guī)消毒后用直徑0.35 mm、長40 mm的華佗牌針灸針進行針刺“后三里”穴、“陽陵泉”穴［12－20］。得氣后接通電針治療儀，采用疏密波形，頻率1～4 Hz，輸出強度為1～3 mA，持續(xù)20 min，以局部肌肉輕微抖動為度。每日1次，連續(xù)治療14天。藥物組:將塞來昔布溶入到10%的二甲基亞砜(DMSO)中，按照人與動物體重換算公式 Meeh －Rubner折合成大鼠量［11，19－20］，給予每只大鼠3 mg·(kg－1·2ml－1)灌胃量，每天灌藥 1 次，連續(xù)給藥14天。

Meeh－Rubner換算公式:A=K·W2/3/10 000。

注:A代表體表面積，K代表系數(shù)，W代表體重(g)。

2.5 標本的采集與保存

于實驗第4周采用頸椎脫臼法處死全部大鼠，將大鼠固定于固定板上，伸直關節(jié)，切開皮膚，將整個關節(jié)取下攝像保存并作大體觀察。切開皮下組織、深筋膜、切斷內外側副韌帶，顯露出整個膝關節(jié)面，肉眼觀察膝關節(jié)面、關節(jié)軟骨以及滑膜變化并攝像保存。將膝關節(jié)置于冰上，用銳利刀片取膝關節(jié)正中部分的滑膜組織約50 mg，去除周圍的脂肪組織，剪碎分裝置于1.5 ml的離心管中，加入 Trizol試劑0.5 ml手動勻漿器攪碎組織，于4℃下1000 g離心20 min，提取上清液置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 標本檢測

雙抗體夾心elisa法檢測各組MMP－3和TIMP－1的含量。參考試劑盒說明書配置所需溶液，并配置標準品梯度:MMP －3:2000，1000，500，250，125，62.5，31.2 pg/ml;TIMP －1:800，400，200，100，50，25，12.5 pg/ml。在空白孔、標準孔和樣品孔分別加入50 μl ASSAY稀釋液，然后在空白孔、標準孔和樣品孔分別加入50 μl樣本稀釋液、標準品和樣本;室溫孵育2 h;用洗液沖洗4次;每孔加入100 μl酶結合物工作液;室溫孵育2 h;用洗液沖洗4次;每孔加入100 μl顯色底物;避光室溫孵育30 min;每孔加入100 μl終止液;混勻，用酶標儀在450 nm處測吸光值;繪制標準曲線:以標準品濃度對數(shù)為橫坐標，以測得的OD值為縱坐標，繪制標準曲線;根據(jù)OD值計算各個指標含量。

注:各滑膜組織中的MMP－3和TIMP－1濃度用μg/g蛋白來表示。

2.7 統(tǒng)計學分析

3 實驗結果

在本實驗整個操作過程中未對大鼠造成明顯創(chuàng)傷，故實驗中無大鼠的脫落，40只大鼠全部納入結果分析。

3.1 動物觀察

模型組大鼠在關節(jié)腔注入MIA后3天左右發(fā)病，以左側關節(jié)腫脹、活動受限為主，隨著時間的增加關節(jié)腫脹持續(xù)加重，部分腫脹關節(jié)局部皮膚充血、發(fā)亮、增厚，左側肢體出現(xiàn)跛行，觸摸其左側關節(jié)老鼠會有明顯的躲避行為，大鼠整個狀態(tài)表現(xiàn)為倦怠，進食減少，體重約在14天左右開始明顯下降。藥物治療組跟針灸組大鼠的癥狀在14天干預治療后明顯改善，而造模組則持續(xù)加重。正常組體重增長正常，毛發(fā)光滑，活動自如。

3.2 關節(jié)及關節(jié)軟骨肉眼觀察

關節(jié)及關節(jié)軟骨肉眼觀察見表1及圖1。

表1 SD大鼠離體關節(jié)大體觀

圖1 SD大鼠離體關節(jié)大體觀

3.3 4組大鼠滑膜組織中MMP－3和TIMP－1蛋白表達水平比較

模型組、藥物組、電針組各組 MMP－3、TIMP－1蛋白水平相對表達量均較正常組顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但在模型組中兩個指標變化并不同步，MMP－3比TIMP－1表達量增加得多;模型組、藥物組、電針組各組之間兩兩比較，藥物組和電針組中MMP－3和TIMP－1的相對表達量明顯降低，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，可見藥物組和電針組對膝骨關節(jié)炎 MIA模型大鼠滑膜組織中 MMP－3和TIMP－1均有明顯下調作用，但是藥物組和電針組之間MMP－3和TIMP－1兩個指標的表達均無顯著性差異(P ＞0.05)。見表2。

表2 各組MMP－3/TIMP在滑膜組織中的表達量(±s，μg/g)

表2 各組MMP－3/TIMP在滑膜組織中的表達量(±s，μg/g)

組別 n MMP－3 TIMP－1正常組10 11.91 ±0.31 10.52 ±0.40模型組 10 32.45 ±0.45 13.34 ±0.52藥物組 10 12.37 ±0.67 10.83 ±0.61電針組10 11.90 ±1.24 10.81 ±1.08

4 討論

以往的實驗研究表明大鼠在發(fā)育期雌性較雄性骨量變化有明顯差異［21］，而且雌性大鼠有明顯的生理周期［22］，為了避免自身生理因素給實驗帶來的影響，本研究選用雄性大鼠作為實驗動物。

膝骨關節(jié)炎實驗動物模型的制備方法很多［23－24］，本研究采用的是向單側膝關節(jié)腔內注射單體碘乙酸鈉(MIA)的方法進行造模。研究表明［10，25］:單體碘乙酸鈉是一種糖酵解抑制劑，將其注入大鼠單側膝關節(jié)內能夠在較短時間內誘發(fā)大鼠形成類似于人體的膝骨關節(jié)炎病理狀態(tài)。造模后兩周即可出現(xiàn)軟骨表面的凹陷以及裂隙、整個關節(jié)增粗等病理表現(xiàn)，造模4周后即可出現(xiàn)滑膜纖維化以及關節(jié)軟骨的進一步裂變，并伴隨骨贅形成。本研究在造模兩周后介入干預措施，可以有效觀察干預措施對此病理狀態(tài)的改變和影響。

大量國內外臨床研究表明，電針在治療膝骨關節(jié)炎方面有其獨特優(yōu)勢，能夠有效緩解膝骨關節(jié)炎引起的疼痛、關節(jié)僵硬以及功能性障礙［26］。臨床上，針灸治療膝骨關節(jié)炎多以局部疏通經(jīng)脈、調理氣血為主，電針局部“足三里”穴、“陽陵泉”穴可以有效改善膝關節(jié)局部的血液循環(huán)，減輕滑膜炎癥，起到防衛(wèi)免疫、抗病鎮(zhèn)痛的作用，有利于關節(jié)炎的恢復［27］。因此，本研究參照《實驗針灸學》等，選取大鼠膝關節(jié)處，與人類膝關節(jié)“足三里”穴、“陽陵泉”穴相對應的“后三里”穴、“陽陵泉”穴進行電針治療。此外，相對于傳統(tǒng)針灸治療的方式，針刺后連通電針儀進行電針治療，可以準確掌握刺激參數(shù)，量化刺激強度。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一類存在于軟骨細胞外的蛋白水解酶家族，可以降解細胞外基質的大多數(shù)蛋白質。MMP－3是MMPs家族的主要成員之一，它不僅可以降解細胞外基質膜成分，而且能分泌大量的細胞外分子［28］，在成纖維細胞的增生中起著重要的媒介作用［29］。TIMPs是一種內源性的、分布廣泛的低分子生理性抑制劑，由滑膜及軟骨細胞合成，能夠與MMPs以共價鍵形式結合成1:1的復合物，從而抑制絕大多數(shù)的MMPs［30］。研究表明，MMP－3和 TIMP－1能夠相互結合和制約，是參與膝骨關節(jié)炎病程發(fā)展的重要物質［31］。在膝骨關節(jié)炎患者的滑膜和軟骨組織中，MMP－3和 TIMP－1的表達均顯著增加，但TIMP－1增加的程度相對較小，打破了MMP－3和TIMP－1之間原本的平衡［32］，這種失衡狀態(tài)造成膝關節(jié)軟骨外基質降解，使得膝關節(jié)出現(xiàn)一系列退變表現(xiàn)。在本研究中，正常組、電針組和藥物組大鼠滑膜組織中亦存在少量MMP－3和TIMP－1且基本保持平衡，意味著可能正是這種動態(tài)平衡保證了軟骨細胞正常的代謝水平，而在模型組MMP－3有明顯的高表達，隨之TIMP－1的表達也升高，但是兩者的表達并不同步，使得MMP－3和TIMP－1的平衡遭到破壞，與文獻報道一致，雖然這與之前的另外一篇文獻報道［18］中MMP－3和TIMP－1的變化趨勢稍有差異，恰好說明了這種平衡可能并非靜止狀態(tài)，而是處在一個動態(tài)變化中，電針所起的作用可能正好糾正了兩者之間的不平衡，使兩者歸于平衡狀態(tài)。

本實驗采用分子生物學方法對電針治療大鼠膝骨關節(jié)炎MIA模型進行了研究，并對電針療法的可能作用機制進行探討，證明了針灸能夠有效糾正MMP－3和TIMP－1在滑膜組織中的異常表達，從而發(fā)揮治療作用，為針灸治療膝骨關節(jié)炎提供了可靠的實驗證據(jù)。

注:感謝美國雅培公司的Steve McGaraughty博士對本研究造模部分提供的指導與支持。

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