高效土著花生根瘤菌篩選的初步研究

劉世旺，劉建英，徐艷霞，徐君馳

(1.黃岡師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃州 438000；2.黃岡市蔬菜辦公室，湖北 黃州 438000)

?

高效土著花生根瘤菌篩選的初步研究

劉世旺1，劉建英2，徐艷霞1，徐君馳1

(1.黃岡師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃州 438000；2.黃岡市蔬菜辦公室，湖北 黃州 438000)

利用YMA培養(yǎng)基，從新鮮花生根瘤中分離得到黃岡土著花生根瘤菌6株，分別編號(hào)為HG-1、HG-2、HG-3、HG-4、HG-5、HG-6。選取黃岡地區(qū)廣泛使用的3個(gè)花生品種(紅花1號(hào)、紅花2號(hào)、中花1號(hào))對(duì)6個(gè)菌株進(jìn)行盆栽回接實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：接種根瘤菌的花生植株都有結(jié)瘤，所有菌株均為花生根瘤菌。通過(guò)比較根瘤數(shù)量和質(zhì)量，初步篩選出與花生品種紅花1號(hào)、紅花2號(hào)、中花1號(hào)具有最佳共生固氮匹配關(guān)系的根瘤菌菌株分別是HG-5、HG-3、HG-2。

根瘤菌；花生；共生固氮；篩選

花生根瘤菌是與花生共生、形成根瘤并固定空氣中的氮?dú)夤┗ㄉ鸂I(yíng)養(yǎng)的一類桿狀細(xì)菌。這種共生體系的固氮能力雖然很強(qiáng)，但也受氣候、土壤類型、花生品種等多種因素的影響[1-2]。根瘤菌能最大限度發(fā)揮固氮作用的共生組合關(guān)系叫親組合。一定自然條件下，一定區(qū)域內(nèi)的花生能與該區(qū)域內(nèi)的土著根瘤菌形成親組合。篩選與當(dāng)?shù)鼗ㄉ贩N匹配性好、固氮能力強(qiáng)的高效優(yōu)良菌株，是提高根瘤菌應(yīng)用效果的重要途徑[3]。黃岡是花生種植大市，現(xiàn)轄7縣2市1區(qū)1農(nóng)場(chǎng)，僅紅安縣花生種植面積就占到了湖北省花生種植總面積的1/10[4]。為了篩選適合本地花生利用的親組合菌株，我們選取大別山地區(qū)普遍栽種的3個(gè)花生品種作為試驗(yàn)材料，利用無(wú)菌接種栽培法對(duì)我們分離得到的6株土著花生根瘤菌進(jìn)行了回接實(shí)驗(yàn)，初步篩選出了高效土著花生根瘤菌3株，為該地區(qū)進(jìn)一步篩選和應(yīng)用高效花生根瘤菌奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 先分別從湖北黃岡市郊及紅安、麻城、武穴等地不同類型土壤中采集花生根瘤，然后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離、純化及生物學(xué)特征鑒定得到6個(gè)黃岡土著花生根瘤菌株，分別編號(hào)為HG-1、HG-2、HG-3、HG-4、HG-5、HG-6。

1.1.2 供試花生品種 紅花1號(hào)、紅花2號(hào)和中花1號(hào)，購(gòu)自湖北省黃岡市種子公司，選擇顆粒大小均勻、子葉飽滿、種皮色澤鮮亮、無(wú)霉點(diǎn)的種子用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 試劑及設(shè)備 NaCl 、KCl、CaSO4、MgSO4、Ca3(PO4)2、K2HPO4、FeSO4等均為分析純?cè)噭?。恒溫光照培養(yǎng)箱PYX-300G-B由韶關(guān)科力實(shí)業(yè)儀器公司生產(chǎn)。

1.1.4 培養(yǎng)基配方 牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基和YMA培養(yǎng)基[5]；結(jié)晶紫YMA培養(yǎng)基(100 mL YMA培養(yǎng)基中加0.1%結(jié)晶紫乙醇溶液0.1 mL)；剛果紅YMA培養(yǎng)基(100 mL YMA培養(yǎng)基中加0.5%剛果紅液1 mL)。

1.2 方法

1.2.1 花生根瘤菌的分離純化 用剪刀剪下采回的花生植株根瘤，用自來(lái)水清洗根瘤泥土，吸水紙吸干，用75%乙醇表面消毒1 min，0.1%升汞消毒5 min，無(wú)菌水沖洗5次，備用。將表面消毒的根瘤置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，壓碎根瘤并沾取汁液，先在結(jié)晶紫YMA培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)(28 ℃)。待長(zhǎng)出菌落后，再在剛果紅YMA培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后挑取不吸色的單菌落再在YMA培養(yǎng)基平板上重復(fù)劃線培養(yǎng)，直至分離得到圓形、表面光滑凸起、濕潤(rùn)黏稠、淺乳白色半透明單菌落為止。為了檢驗(yàn)菌種純度，可將上述純化的菌株接種到牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基平板上，在30 ℃下培養(yǎng)2～4 d，培養(yǎng)基上未見(jiàn)任何菌落即表明菌株很純。經(jīng)革蘭氏染色檢查為陰性桿菌后轉(zhuǎn)入YMA斜面保藏備用。

1.2.2 砂培瓶的準(zhǔn)備 選取細(xì)砂過(guò)40目篩，水洗去雜質(zhì)，烘干，吸除鐵屑，裝入潔凈干燥的口徑3.7 cm、高14.2 cm、容積263 mL的玻璃質(zhì)飲料瓶中，砂子裝入量為瓶高的一半，瓶口用兩層報(bào)紙內(nèi)夾一層棉花包扎。共準(zhǔn)備砂培瓶210個(gè)，同時(shí)準(zhǔn)備上述砂子2袋，包扎好，165～170 ℃干熱滅菌2 h后備用。

1.2.3 菌液的制備 取250 mL三角瓶6個(gè)，各裝入100 mL新配制的YMA培養(yǎng)液，121 ℃濕熱滅菌20 min，于花生播種前5 d分別向瓶?jī)?nèi)接種6種根瘤菌株，并置28 ℃搖床培養(yǎng)5 d。在給花生接種前，根瘤菌菌液要進(jìn)行顯微鏡直接計(jì)數(shù)，并用無(wú)菌水將菌液中菌體濃度稀釋至700～800萬(wàn)個(gè)/mL。

1.2.4 土壤浸出液的制備 在黃岡師范學(xué)院植物園采集土壤1 000 g，裝入2 000 mL燒杯中，再向燒杯中加入自來(lái)水1 000 mL，用玻璃棒攪動(dòng)，在高壓滅菌鍋中，120 ℃下浸提20 min，然后取上清液并用布氏漏斗過(guò)濾，濾液加水至1 000 mL，用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7，121 ℃濕熱滅菌后冰箱冷藏備用。

1.2.5 庫(kù)侖試劑的配制[6]分別取KCl 10.0 g、CaSO4·2H2O 2.5 g、MgSO4·7H2O 2.5 g、Ca3(PO4)22.5 g、FeSO42.5 g置于研缽中，研細(xì)并充分混合，稱取混合物1～3 g溶于1 000 mL蒸餾水中，用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7，121 ℃濕熱滅菌后冰箱冷藏備用。

1.2.6 花生種子的催芽 花生種子先用自來(lái)水充分洗滌，然后用25%H2O2浸泡30 min，其間可用無(wú)菌玻璃棒趕走種子表面的氣泡以提高滅菌效果。將滅過(guò)菌的種子用無(wú)菌水洗滌2～3次，洗去殘留的H2O2；然后把種子盛在無(wú)菌的大小合適的燒杯中，注入適量的無(wú)菌水，然后用棉花和雙層報(bào)紙?jiān)€封口，浸種24 h；將浸種后的種子置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌濾紙覆蓋在培養(yǎng)皿上方，保持濕潤(rùn)，置培養(yǎng)箱中恒溫(25 ℃)催芽4～5 d。

1.2.7 花生的播種和根瘤菌的接種 將砂培瓶分成A、B、C三組，分別對(duì)應(yīng)紅花1號(hào)、紅花2號(hào)、中花1號(hào)等3個(gè)不同的花生品種。每組共準(zhǔn)備70個(gè)砂培瓶，分設(shè)6個(gè)不同菌株項(xiàng)和1個(gè)對(duì)照項(xiàng)，每項(xiàng)重復(fù)10次。播種時(shí)，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求選取健壯且萌發(fā)良好的花生種子植于砂培瓶之中央，胚根向下，每瓶1粒，其上覆蓋約3 cm厚的細(xì)砂，澆入適量無(wú)菌的土壤浸出液，使砂粒全部浸濕而瓶中無(wú)積水，然后接種根瘤菌菌液1 mL。全部操作均為無(wú)菌操作。處理后的砂培瓶置25 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光照時(shí)間為每天6:00～18:00。

1.2.8 花生培養(yǎng)和管理 花生培養(yǎng)的管理需每日進(jìn)行并做好記錄，瓶中表面砂子干燥時(shí)需在無(wú)菌條件下及時(shí)輪流澆入土壤浸出液和庫(kù)侖試劑。當(dāng)花生的主莖生長(zhǎng)至瓶口或高出瓶口時(shí)，僅用棉花塞住瓶口即可。

1.2.9 數(shù)據(jù)的采集和統(tǒng)計(jì) 當(dāng)花生生長(zhǎng)到開(kāi)花時(shí)(約50%植株開(kāi)花，實(shí)際栽培43天)，先用膠管把水緩緩注入瓶中，洗去沙子，再?gòu)钠坷镄⌒牡匕纬龌ㄉ母透?。再次將根放入清水中，可將根系中纏繞的部分解開(kāi)。按不同實(shí)驗(yàn)處理分別統(tǒng)計(jì)花生結(jié)瘤特征值和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)特征值。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種對(duì)紅花1號(hào)花生營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和根瘤形成的影響

根據(jù)表1數(shù)據(jù)計(jì)算可知，培養(yǎng)植株莖高平均值為18.33 cm，各實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值圍繞平均值上下波動(dòng)范圍<3.5%；葉片數(shù)平均值為7.29片，上下波動(dòng)范圍<4.3%；地上部分鮮重平均值為4.096 g，但上下波動(dòng)范圍較大，達(dá)14.2%。數(shù)據(jù)分析表明接種土著根瘤菌對(duì)紅花1號(hào)花生主莖高度和葉片數(shù)影響較小，而對(duì)植株總生物量影響較大，植株外觀上明顯表現(xiàn)為有些實(shí)驗(yàn)項(xiàng)的植株比較纖細(xì)(如HG-4)，有些實(shí)驗(yàn)項(xiàng)的植株比較粗壯(如HG-2和HG-5)。接種后，所有花生根部都結(jié)瘤(CK不結(jié)瘤)，證明我們分離純化得到的菌株確實(shí)為花生根瘤菌，但不同菌株共生結(jié)瘤能力有較大差別，其中HG-5菌株與紅花1號(hào)花生共生結(jié)瘤能力最強(qiáng)，各結(jié)瘤指標(biāo)值均優(yōu)于其它菌株，其中側(cè)根根瘤數(shù)的測(cè)定值是最少實(shí)驗(yàn)項(xiàng)(HG-6)的3.03倍，是6個(gè)菌株組平均值的1.33倍。

表1 接種對(duì)紅花1號(hào)花生生長(zhǎng)和結(jié)瘤的影響(株)

2.2 接種對(duì)紅花2號(hào)花生營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和根瘤形成的影響

表2 接種對(duì)紅花2號(hào)花生生長(zhǎng)和結(jié)瘤的影響(株)

從表2可見(jiàn)，接種對(duì)紅花2號(hào)花生的主莖高度和主莖葉片數(shù)影響很小，各菌株接種項(xiàng)與對(duì)照項(xiàng)之間無(wú)顯著差異，實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值圍繞平均值上下波動(dòng)范圍都在5%以內(nèi)。對(duì)于地上部分鮮重指標(biāo)，僅個(gè)別菌株實(shí)驗(yàn)項(xiàng)觀測(cè)值偏離平均值較遠(yuǎn)(HG-1項(xiàng)比平均值低11.73%)，而多數(shù)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)的觀測(cè)值波動(dòng)很小，外觀上植株表現(xiàn)為長(zhǎng)勢(shì)比較整齊。接種根瘤菌后，花生根部均有根瘤形成，但不同菌株刺激形成的根瘤數(shù)量也有較大變化，其中HG-3菌株與紅花2號(hào)花生共生結(jié)瘤效果最好，其主根根瘤數(shù)、側(cè)根根瘤數(shù)、最大根瘤直徑及根瘤鮮重等四個(gè)結(jié)瘤相關(guān)觀測(cè)值分別高于平均值42.37%、38.07%、31.97%和41.43%。

2.3 接種對(duì)中花1號(hào)花生營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和根瘤形成的影響

表3 接種對(duì)中花1號(hào)花生生長(zhǎng)和結(jié)瘤的影響(株)

從表3可知，接種對(duì)中花1號(hào)花生莖高和葉片數(shù)的影響也較小，各實(shí)驗(yàn)組觀測(cè)值圍繞平均值上下波動(dòng)范圍<3.5%。植株地上部分鮮重值上下波動(dòng)11%左右，外觀上，中花1號(hào)比紅花1號(hào)花生的長(zhǎng)勢(shì)要整齊一些。從結(jié)瘤情況看，HG-2菌株與中花1號(hào)共生結(jié)瘤能力最強(qiáng)，其主根根瘤數(shù)、側(cè)根根瘤數(shù)、最大根瘤直徑及根瘤鮮重等四個(gè)結(jié)瘤相關(guān)觀測(cè)值分別高于平均值43.18%、30.30%、32.84%和52.58%。

2.4 不同花生品種對(duì)根瘤形成的影響

根瘤菌與花生之間共生固氮能力的強(qiáng)弱往往與回接實(shí)驗(yàn)時(shí)花生根部結(jié)瘤多少及質(zhì)量?jī)?yōu)劣相對(duì)應(yīng)。結(jié)瘤特征值通常有五項(xiàng)，即主根根瘤數(shù)、側(cè)根根瘤數(shù)、最大根瘤直徑、根瘤鮮重及根瘤總數(shù)。三種不同花生品種接種根瘤菌后的前4項(xiàng)結(jié)瘤特征值參見(jiàn)表1～3，第5項(xiàng)特征值，即根瘤總數(shù)統(tǒng)計(jì)如表4。由表4知，花生品種對(duì)花生根瘤總數(shù)有很大影響，表現(xiàn)為不同花生品種與不同菌株之間的匹配程度不同，同時(shí)還可明顯看出，紅花1號(hào)與HG-5、紅花2號(hào)與HG-3、中花1號(hào)與HG-2之間分別具有最好的結(jié)瘤匹配性，它們兩兩之間共生時(shí)具有較大的結(jié)瘤固氮潛力。另外，紅花2號(hào)與HG-5、HG-2之間也有較好的結(jié)瘤匹配性，根瘤總數(shù)也較多，顯示出紅花2號(hào)花生品種具有更好的土壤環(huán)境適應(yīng)性。

表4 不同花生品種根瘤總數(shù)統(tǒng)計(jì)表

3 小結(jié)

花生屬熱帶亞熱帶豆科植物，其根瘤正常繁殖、活動(dòng)和固氮的最適溫度為18～28 ℃，花生同時(shí)也是喜光的C3植物，光飽和點(diǎn)和CO2補(bǔ)償點(diǎn)均較高，光合作用的最適溫度為20～25 ℃?；ㄉ鼍鷮俸脷猱愷B(yǎng)菌，單獨(dú)生長(zhǎng)繁殖的最適溫度為25～30 ℃。通過(guò)多因子比較實(shí)驗(yàn)，選擇25 ℃、光照12 h/d的回接實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)是花生生長(zhǎng)和結(jié)瘤的最適條件。

在回接實(shí)驗(yàn)中，所有被接種的花生植株均有根瘤形成(CK項(xiàng)不結(jié)瘤)，這充分證明我們分離得到的6個(gè)菌株均為花生根瘤菌。

在回接實(shí)驗(yàn)中，紅花2號(hào)花生品種不僅與HG-3菌株具有很好的結(jié)瘤匹配性，同時(shí)還與HG-2、 HG-5等具有較好的結(jié)瘤匹配性，說(shuō)明紅花2號(hào)品種具有較好的土壤適應(yīng)性、比較適宜在黃岡地區(qū)廣泛種植，這與我們?cè)缙诘难芯拷Y(jié)論一致[7]。

在回接實(shí)驗(yàn)中，不同花生品種與不同根瘤菌株之間形成組合(共生)時(shí)，其結(jié)瘤特征值差異明顯。對(duì)于匹配性好的組合，如紅花1號(hào)與HG-5組合、紅花2號(hào)與HG-3組合、中花1號(hào)與HG-2組合等，其結(jié)瘤特征值均明顯優(yōu)于其它組合。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力說(shuō)明，在花生種植實(shí)踐中篩選親組合、推廣具有親組合關(guān)系的花生品種和高效菌肥具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

[1] 周濤，陳遠(yuǎn)學(xué)，鄒依霖，等．四川高效大豆根瘤菌的篩選及初步應(yīng)用研究[J]．植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2012,18(1)：227-233．

[2] 羅明云．4株高效共生花生根瘤菌的篩選[J]. 西華師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003，24(4)：426-430．

[3] 吳萍，何慶元，李正鵬，等．高效大豆根瘤菌篩選的初步研究[J]．安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2013, 27(3)：29-32．

[4] 馬皓，郭愛(ài)紅，馮旭東，等．紅安縣花生產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的現(xiàn)狀與對(duì)策[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊，2013，(3)：8-10．

[5] 何紹江，陳雯莉．微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007：155-162.

[6] 土壤微生物研究會(huì)(日)．土壤微生物實(shí)驗(yàn)法[M]．北京：科學(xué)出版社，1983：329-350.

[7] 劉世旺，王寶林，陶佳喜，等．溫度、光照和接種時(shí)間對(duì)花生生長(zhǎng)和結(jié)瘤的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，46(1)：49-51,67．

(李鑫)

Preliminary study on screening of efficient indigenous peanut rhizobia

LIU Shi-wang1， LIU Jian-ying2, XU Yan-xia2， XU Jun-chi1

(1.College of Life Science，Huanggang Normal University， Huangzhou 438000，Hubei, China;2.Huanggang City Vegetable Administration Office, Huangzhou 438000，Hubei, China)

6 strains of indigenous rhizobia in the area of Huanggang have been isolated from fresh peanut nodule extracts with YMA medium. They were separately named as HG-1，HG-2，HG-3，HG-4，HG-5 and HG-6. The isolated strains were inoculated back onto 3 varieties of peanut plants (Honghua-1, Honghua-2, Zhonghua-1) that are widely sowed in Huanggang. The results of the experiment in sand bottles show that all the peanut plants can nodulate after being inoculated with the strains，and all the isolated strains are peanut rhizobia. By comparing quantity and weight of nodule, it is known that the strain HG-5 symbiotic nitrogen-fixing effect matches best with the peanut plant Honghua-1. So does HG-3 with Honghua-2, and HG-2 with Zhonghua-1.

rhizobium; peanut; symbiotic nitrogen-fixing; screening

S154.39

A

1003-8078(2014)03-0019-05

2014-02-28 doi 10.3969/j.issn.1003-8078.2014.03.06

劉世旺，男，湖北武漢人，教授，碩士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)及生物資源開(kāi)發(fā)利用。

徐艷霞，女，湖北武漢人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，E-mail: swxyx@hgnu.edu.cn.

湖北省教育廳高校產(chǎn)學(xué)研合作資助項(xiàng)目(No.C2010061)資助。