溫度脅迫對(duì)荒漠昆蟲(chóng)小胸鱉甲(鞘翅目:擬步甲科)幼蟲(chóng)熱激蛋白基因hsp70 表達(dá)的影響

石 萌，劉曉靜，劉小寧，馬 紀(jì)

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046)

熱激蛋白(Heat shock proteins，HSP)是生物響應(yīng)環(huán)境脅迫時(shí)體內(nèi)合成的一類蛋白質(zhì)(Lindquist，1986)，許多環(huán)境因素的脅迫都會(huì)誘導(dǎo)生物體內(nèi)產(chǎn)生HSP，如溫度、干燥、金屬離子、病原體等(Zhao and Jones，2012)。根據(jù)序列同源性及分子量大小可將HSP 分為不同的家族，主要包括 HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 及 sHSP(Feder and Hofmann，1999)，其中HSP70 最為保守，研究得最為廣泛。HSP70 家族由兩種不同的基因編碼，一種是組成型的hsc70，一種是誘導(dǎo)型的hsp70，這兩種基因都編碼在細(xì)胞中作為分子伴侶發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)(Gething and Sambrook，1992)。

昆蟲(chóng)在應(yīng)對(duì)高溫刺激時(shí)，HSP的熱激響應(yīng)非常顯著與普遍。例如，用高溫預(yù)處理南美斑潛蠅Liriomyza huidobrensis 可顯著增加hsp70 和hsp20 基因的表達(dá)并提高其耐熱性(Huang et al.，2007)。不同發(fā)育階段的赤擬谷盜Tribolium castaneum 在40℃處理1 h 后，hsp70 I 基因的轉(zhuǎn)錄水平比對(duì)照增加了1.1-2.0 倍(Mahroof et al.，2005)。42℃處理荒漠甲蟲(chóng)謝氏寬漠王Mantichorula semenowi Reitter 1 h后hsp70 表達(dá)至最高峰(唐婷等，2008)。

昆蟲(chóng)應(yīng)對(duì)低溫刺激時(shí)，不同物種HSP的響應(yīng)方式有較大差異。滯育期越冬昆蟲(chóng)的HSP 普遍存在上調(diào)現(xiàn)象，并被認(rèn)為是提高滯育期昆蟲(chóng)耐寒性的主要因素(Rinehart et al.，2007)。HSP 對(duì)低溫誘導(dǎo)的響應(yīng)溫度可以確定兩種斑潛蠅的地理分布界限，耐寒性強(qiáng)的南美斑潛蠅的最低誘導(dǎo)溫度比更耐熱的美洲斑潛蠅Liriomyza sativae 要低2℃(Huang and Kang，2007)。在-7℃處理果蠅Drosophila melanogaster 1 h 室溫恢復(fù)30 min 后，hsp70的相對(duì)表達(dá)量顯著上升，存活率也顯著高于對(duì)照(Udaka et al.，2010)。荒漠昆蟲(chóng)光滑鱉甲Anatolica polita 在-5℃脅迫10 min 并在室溫恢復(fù)15 min 后hsp70的表達(dá)量顯著升高 (陳亮等，2007)。

在有些昆蟲(chóng)中HSP 也參與發(fā)育過(guò)程。赤擬谷盜的hsp90 基因與復(fù)眼發(fā)育有關(guān) (Knorr and Vilcinskas，2011)。黑腹果蠅雄性配子形成及胚胎發(fā)育期有sHSP的表達(dá) (Joanisse et al.，1998)。煙草天蛾Manduca sexta (Rybczynski and Gilbert，2000)、搖蚊Chironomus (Karouna-Renier et al.，2003)的hsp70 基因表達(dá)受發(fā)育調(diào)節(jié)等。Mahroof等(2005)發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜hsp70 基因在小齡幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)中表達(dá)水平顯著高于老齡幼蟲(chóng)和蛹，且經(jīng)熱激后，小齡幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)hsp70 受到誘導(dǎo)，而老齡幼蟲(chóng)和蛹卻受到抑制，表明不同HSP 對(duì)于昆蟲(chóng)發(fā)育及響應(yīng)環(huán)境脅迫具有重要作用。

在HSP 超家族中，HSP70 對(duì)環(huán)境因子脅迫最為敏感，hsp70 基因普遍上調(diào)表達(dá)(Reuner et al.，2010;Aruda et al.，2011;Guo et al.，2012)。40℃高溫處理棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa zea 30 min 后，其hsp70和hsp90 基因表達(dá)均受到熱誘導(dǎo)，且hsp70 相比hsp90 更加強(qiáng)烈(Zhang and Denlinger，2010)。冷處理黑腹果蠅Drosophila melanogaster 后，多種hsp基因都上調(diào)表達(dá)，但hsp70 基因?qū)涿{迫響應(yīng)最強(qiáng)烈，其相對(duì)表達(dá)量在冷脅迫及恢復(fù)期間均顯著上調(diào)(Colinet et al.，2010)。甜菜夜蛾Spodoptera exigua 中，hsp70 對(duì)高溫和低溫的響應(yīng)程度比hsp90更強(qiáng)烈，且hsp90 和hsp70 對(duì)溫度的響應(yīng)程度因發(fā)育階段的不同而變化，表明除了熱激響應(yīng)外，它們可能還參與昆蟲(chóng)的發(fā)育(Jiang et al.，2012)。此外，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)小胸鱉甲Microdera punctipennis 成蟲(chóng)在42℃處理1 h 后hsp70 受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)，可達(dá)對(duì)照的400 倍 (馬文靜和馬紀(jì)，2012)?；诶ハx(chóng)中hsp70 基因表達(dá)對(duì)溫度脅迫響應(yīng)的普遍性及強(qiáng)烈程度，本研究對(duì)小胸鱉甲幼蟲(chóng)hsp70 基因在不同發(fā)育階段及溫度脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行研究。

擬步甲科昆蟲(chóng)是干旱荒漠區(qū)的主要生物類群，小胸鱉甲是古爾班通古特沙漠的擬步甲科特有種(黃人鑫等，2005)，其幼蟲(chóng)共有7個(gè)齡期，在30℃的總歷期為56 d，整個(gè)發(fā)育階段均生活在淺層沙土中(Wang et al.，2011)。其中1 齡幼蟲(chóng)歷期為3 d，期間幼蟲(chóng)基本不進(jìn)食，直接蛻皮成為2 齡幼蟲(chóng)，進(jìn)入2 齡時(shí)體重幾乎不變，由于1 齡幼蟲(chóng)體內(nèi)積累了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如糖原等，因此相比其它齡期，1 齡幼蟲(chóng)具有最低的過(guò)冷卻點(diǎn)(劉曉靜等，2012);從2-3 齡開(kāi)始體重迅速增加，但體重基數(shù)很小;4 齡是小齡與大齡幼蟲(chóng)之間的過(guò)渡期，其增長(zhǎng)速率低于其他齡期的幼蟲(chóng)，推測(cè)其體內(nèi)各類物質(zhì)的合成正處于準(zhǔn)備階段，此時(shí)體內(nèi)含水量最高;而5-7 齡幼蟲(chóng)體重的增加則進(jìn)入迅猛發(fā)展期，其中7 齡幼蟲(chóng)表皮較厚，含水量較低。由于HSP 具有抗細(xì)胞凋亡和抗氧化等功能，并能通過(guò)防止蛋白質(zhì)變性來(lái)保護(hù)細(xì)胞，從而提高了細(xì)胞對(duì)溫度脅迫或傷害的耐受性，因此熱激蛋白在昆蟲(chóng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用，研究小胸鱉甲幼蟲(chóng)的hsp70 基因在不同溫度下的表達(dá)變化將有助于了解其對(duì)荒漠環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制。在不同生物中熱激蛋白參與逆境脅迫響應(yīng)的方式有較大不同(Feder and Hofmann，1999;Huang et al.，2009;Gross et al.，2009;Karl et al.，2009)，然而對(duì)耐干旱抗低溫的荒漠?dāng)M步甲科昆蟲(chóng)的相關(guān)研究卻非常有限。本文在前期對(duì)小胸鱉甲成蟲(chóng)hsp70 克隆表達(dá)的基礎(chǔ)上(馬文靜和馬紀(jì)，2012)，研究了小胸鱉甲幼蟲(chóng)在發(fā)育過(guò)程中以及高低溫對(duì)幼蟲(chóng)hsp70 表達(dá)的影響，結(jié)合幼蟲(chóng)在低溫條件下的耐寒性，從分子伴侶的角度對(duì)荒漠昆蟲(chóng)的環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲(chóng)源

實(shí)驗(yàn)所用小胸鱉甲各齡期幼蟲(chóng)均飼養(yǎng)于30℃恒溫培養(yǎng)箱(光周期為16L∶8D)中，并根據(jù)幼蟲(chóng)的發(fā)育歷期、體重、體長(zhǎng)和頭殼寬度，來(lái)判定幼蟲(chóng)齡期(Wang et al.，2011)。

1.1.2 主要試劑

SYBR Green Supermix kit、Trizol 試劑購(gòu) 自Invitrogen 公司，Taq 酶、DNase I、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、Oligo (dT)、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)、DNA Marker、pMD18-T均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)，SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒及DEPC 購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，大腸桿菌DH 5α菌株為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 小胸鱉甲幼蟲(chóng)的溫度處理及存活率統(tǒng)計(jì)

選取1-7 齡大小均勻的小胸鱉甲幼蟲(chóng)置于培養(yǎng)皿中，分別于42℃、5℃和10℃恒溫培養(yǎng)箱中處理1、3、5、7 h，以正常飼養(yǎng)的幼蟲(chóng)作為對(duì)照，即0 h 處理。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行組，其中每組1-2 齡100 頭，3 齡30 頭，4 齡10 頭，5 齡3 頭，6-7 齡2 頭。

選取1、4、7 齡大小均勻的小胸鱉甲幼蟲(chóng)置于培養(yǎng)皿中，分別于5℃和10℃低溫培養(yǎng)箱中處理2 h 后直接轉(zhuǎn)置于-10℃處理1 h 后統(tǒng)計(jì)存活率，以正常飼養(yǎng)的幼蟲(chóng)于-10℃處理1 h為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行組，每組20 頭幼蟲(chóng)。

1.2.2 小胸鱉甲幼蟲(chóng)總RNA的提取和cDNA 合成

將試蟲(chóng)置于裝有液氮的研缽中研磨成粉末，用不銹鋼匙把粉末轉(zhuǎn)加于1 mL的Trizol 裂解液中，振蕩混勻，使細(xì)胞充分裂解，然后以200μL 氯仿進(jìn)行抽提，再加入等體積異丙醇沉淀，然后用無(wú)水乙醇及75%乙醇分別洗滌后晾干，加入DNase I消化反應(yīng)液溶解沉淀，于37℃水浴鍋中消化30 min，再分別用氯仿抽提，異丙醇沉淀及75%乙醇洗滌，將RNA 沉淀室溫干燥后，溶于DEPC處理水中，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，用NanoDrop ND-1000 分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies，Wilmington，USA)檢測(cè)RNA的濃度和純度。cDNA的合成以1μg 總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄用Oligo (dT)作下游引物，70℃保溫10 min 后迅速于冰上冰鎮(zhèn)2 min 以上。用MLV 反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，42℃保溫1 h，70℃保溫15 min 后冰上冷卻，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及反應(yīng)程序

根據(jù)小胸鱉甲hsp70 全長(zhǎng)基因的cDNA 序列(GenBank 登錄號(hào)為JF421286)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR 引物。其中目的基因hsp70及內(nèi)參基因β-actin 核心片段的擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為118 bp 和 120 bp。hsp70 引物序列為 hspF:AAGAACGACAAGGGCAGACTG，hspR:CCTTCTA ATTGATTCCTAGCCGCT;β-actin 引物序列為actinF:TACTCCGTATGGATCGGTGGATC，actinR:TTAGAAGCACTTGCGGTGGAC。

為構(gòu)建檢測(cè)目的基因mRNA 表達(dá)水平差異的標(biāo)準(zhǔn)品，以cDNA為模板，PCR 擴(kuò)增目的基因相應(yīng)片段，構(gòu)建pMD18-T 重組質(zhì)粒，經(jīng)上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證，并使用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒。對(duì)制備的重組質(zhì)粒溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/280 以分析純度，并記錄原始濃度，儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。將標(biāo)準(zhǔn)品用DEPC 處理水按10 倍梯度稀釋，用作熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)按帶有ROX的Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG的使用說(shuō)明進(jìn)行。取等量cDNA 進(jìn)行PCR 反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。于GeneAmp Thermal Cycler 7500 中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)，程序?yàn)?50℃2 min;95℃2 min;95℃15 s，58℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT法。本實(shí)驗(yàn)以小胸鱉甲β-actin 基因作為內(nèi)參基因，Hou 等(2010)研究表明小胸鱉甲β-actin 在-7℃、4℃、30℃和45℃脅迫2 h 以及常溫飼養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組中具有恒定的表達(dá)量，其mRNA的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著性差異，表明小胸鱉甲β-actin 可作為外界環(huán)境脅迫作用下基因轉(zhuǎn)錄水平高低的內(nèi)參基因。hsp70 基因表達(dá)量是與內(nèi)參基因相比的相對(duì)表達(dá)量，并以未處理的對(duì)照組進(jìn)行歸一化處理，在比較各齡幼蟲(chóng)hsp70的表達(dá)時(shí)，以1 齡做歸一化。采用醫(yī)學(xué)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 4.0 中的單因素方差分析和Turkey 多重比較分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小胸鱉甲幼蟲(chóng)的總RNA

用不同溫度處理小胸鱉甲幼蟲(chóng)后，提取總RNA 進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，獲得了條帶完整清晰的總RNA，并具有昆蟲(chóng)總RNA 所特有的18S的亮度是28S的兩倍以上的特征，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)表明OD260/280 值均在1.9-2.1 之間，純度較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 小胸鱉甲hsp70 基因及內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在實(shí)時(shí)定量PCR 中，小胸鱉甲β-actin (內(nèi)參基因)及熱激蛋白基因hsp70的熔解曲線較好，無(wú)雜峰出現(xiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，且陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線。兩個(gè)基因的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線R2分別為0.996和0.997，可在較寬范圍內(nèi)用于小胸鱉甲hsp70 基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)。

2.3 小胸鱉甲幼蟲(chóng)hsp70 基因的發(fā)育階段性表達(dá)

在室溫條件下，小胸鱉甲各齡幼蟲(chóng)hsp70 mRNA的基礎(chǔ)水平有較大差異，以1 齡幼蟲(chóng)的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，變化規(guī)律是:大齡(6-7 齡) ＞小齡(1-2 齡) ＞中齡(3-5 齡) (圖1)，其中在5 齡最低，只有1 齡的39.3%，在3 齡只有1 齡的58.8%。而在大齡幼蟲(chóng)(6-7 齡)中則顯著升高，其中6 齡的表達(dá)量最高，為1 齡的5.4 倍(P＜0.05)，6 齡與7 齡之間無(wú)顯著差異，表明小胸鱉甲hsp70的mRNA 水平受發(fā)育階段影響。HSP70的功能不僅是應(yīng)激，可能還在幼蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。

圖1 小胸鱉甲各齡幼蟲(chóng)hsp70的mRNA 相對(duì)水平Fig.1 Relative mRNA levels of hsp70 from Microdera punctipennis larvae

2.4 高溫脅迫對(duì)小胸鱉甲幼蟲(chóng)hsp70 基因表達(dá)的影響

小胸鱉甲各齡期幼蟲(chóng)經(jīng)42℃高溫脅迫后，hsp70 基因的相對(duì)表達(dá)量都極顯著地高于對(duì)照(圖2)，在高溫處理1 h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，其中3-5 齡幼蟲(chóng)hsp70的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)分別為對(duì)照組的2666.8、1596.4 和5290.7 倍，大齡幼蟲(chóng) (6-7 齡)達(dá)到對(duì)照的137.2 和131.1 倍，而小齡幼蟲(chóng)(1-2 齡)則分別是對(duì)照組的5.2 和777.4 倍，之后都有不同程度的下降。上述結(jié)果表明除1 齡外，各齡幼蟲(chóng)對(duì)高溫脅迫能做出迅速響應(yīng)，大量合成HSP 進(jìn)行應(yīng)激處理。1 齡幼蟲(chóng)的熱應(yīng)激響應(yīng)程度最弱，并且在42℃脅迫3 h 后hsp70 mRNA 相對(duì)水平才達(dá)到最高，為對(duì)照的12.1 倍左右。

比較小胸鱉甲各齡幼蟲(chóng)的本底hsp70 水平與熱應(yīng)激響應(yīng)的程度，可發(fā)現(xiàn)其間有高度的負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.69，即hsp70的本底水平越低，對(duì)熱應(yīng)激的響應(yīng)程度越高。表明HSP70 在小胸鱉甲幼蟲(chóng)應(yīng)對(duì)高溫脅迫中發(fā)揮重要作用。

圖2 小胸鱉甲各齡幼蟲(chóng)42℃脅迫0、1、3、5、7 h 后hsp70的mRNA 相對(duì)水平Fig.2 Relative mRNA levels of hsp70 from Microdera punctipennis larvae stressed at 42℃for 0，1，3，5，7 h，respectively

2.5 低溫處理對(duì)小胸鱉甲幼蟲(chóng)hsp70 基因表達(dá)的影響

圖3 小胸鱉甲各齡幼蟲(chóng)低溫處理1、3、5、7 h 后hsp70的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Relative mRNA levels of hsp70 from Microdera punctipennis larvae treated at 5℃ (A)and 10℃ (B)for 1，3，5，7 h，respectively

前期對(duì)小胸鱉甲生活習(xí)性的觀察發(fā)現(xiàn)，小胸鱉甲喜溫避光，當(dāng)溫度低于21℃時(shí)就蟄伏不動(dòng)，且以成蟲(chóng)過(guò)冬。因此，本研究采用5℃和10℃低溫處理小胸鱉甲幼蟲(chóng)，這兩個(gè)溫度也是冷馴化經(jīng)常設(shè)置的溫度。另外，根據(jù)小胸鱉甲幼蟲(chóng)hsp70 基因表達(dá)的發(fā)育階段性情況(圖1)，分別選取1 齡(小齡)、4 齡(中齡)和7 齡(大齡)幼蟲(chóng)進(jìn)行低溫處理和hsp70 表達(dá)的檢測(cè)，以便能夠簡(jiǎn)潔地顯示幼蟲(chóng)發(fā)育幾個(gè)有代表性階段的差異情況。結(jié)果顯示經(jīng)5℃和10℃處理后，1 齡幼蟲(chóng)hsp70 mRNA的相對(duì)水平與對(duì)照相比顯著上升(圖3A、3B)(P＜0.05)，在5 h 之內(nèi)分別為對(duì)照的8.2 倍和14.1 倍;4 齡幼蟲(chóng)hsp70 基因的表達(dá)也受5℃和10℃低溫誘導(dǎo)，但程度較弱，在3 h 僅為對(duì)照的2.0 倍和2.9倍;7 齡幼蟲(chóng)hsp70 基因的表達(dá)在長(zhǎng)時(shí)間低溫處理下甚至受到抑制(P＜0.05)，5℃處理3 h 和10℃處理5 h 之后僅為對(duì)照的17.7%和80.5%。但是7 齡幼蟲(chóng)在10℃1 h 時(shí)hsp70的表達(dá)受到誘導(dǎo)，為對(duì)照組的21.9 倍，之后迅速恢復(fù)原水平，甚至還有輕微抑制?？偨Y(jié)5℃和10℃對(duì)小胸鱉甲幼蟲(chóng)hsp70 表達(dá)的影響，可以看出1 齡和4 齡幼蟲(chóng)hsp70的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，并且10℃的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于5℃，但1 齡幼蟲(chóng)的hsp70 對(duì)低溫的響應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于4 齡，而7 齡幼蟲(chóng)hsp70 則在短時(shí)間內(nèi)受10℃的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。

2.6 小胸鱉甲幼蟲(chóng)的低溫存活率

對(duì)小胸鱉甲1 齡、4 齡和7 齡幼蟲(chóng)分別進(jìn)行低溫處理，觀察其在-10℃的存活率。結(jié)果表明，1 齡幼蟲(chóng)無(wú)論是否進(jìn)行冷馴化，在-10℃的存活率都接近100%。4 齡和7 齡幼蟲(chóng)在-10℃的存活率分別為60%和41.7%。而5℃和10℃冷馴化可以使4 齡幼蟲(chóng)在-10℃的存活率從60%提高到85% (P＜0.05)(圖4)。5℃冷處理對(duì)7 齡幼蟲(chóng)在-10℃的存活率無(wú)顯著提高，10℃處理可增加其在-10℃的存活率，但與對(duì)照組無(wú)顯著差異。

圖4 小胸鱉甲1、4、7 齡幼蟲(chóng)低溫處理后的存活率Fig.4 Survival of the 1st，4th，7th instar larvae of Microdera punctipennis under low temperature

3 結(jié)論與討論

溫度是影響荒漠地區(qū)生物生存的主要因素之一，由于昆蟲(chóng)是變溫生物，溫度對(duì)其生存有更直接的影響。HSP70 作為溫度誘導(dǎo)表達(dá)型蛋白在生物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮作用。本研究對(duì)小胸鱉甲幼蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中hsp70 基因的表達(dá)及高低溫對(duì)各齡幼蟲(chóng)hsp70 表達(dá)的影響進(jìn)行了初步研究。由于幼蟲(chóng)在發(fā)育過(guò)程中發(fā)生了很大的生理生化改變，所以我們先對(duì)室溫下幼蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中hsp 基因的內(nèi)源表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明小胸鱉甲大齡幼蟲(chóng)(6-7 齡)中hsp70的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中小齡幼蟲(chóng)。幼蟲(chóng)不同齡期hsp70 差異表達(dá)的現(xiàn)象在其他昆蟲(chóng)中也有報(bào)道(Rybczynski and Gilbert，2000;Karouna-Renier et al.，2003;Mahroof et al.，2005;Xu et al.，2011)，表明HSP 參與昆蟲(chóng)的發(fā)育過(guò)程，幫助分化過(guò)程中大量新合成蛋白質(zhì)的折疊。

目前研究的生物在高溫脅迫時(shí)都可以合成熱激蛋白，本研究表明小胸鱉甲幼蟲(chóng)hsp70 基因不僅響應(yīng)高溫脅迫，而且響應(yīng)程度非常強(qiáng)烈，42℃處理1 h hsp70的表達(dá)量就達(dá)到對(duì)照的5.2-5290.7倍，其中2-5 齡可達(dá)一千至數(shù)千倍。荒漠昆蟲(chóng)hsp70 基因?qū)Ω邷厝绱藦?qiáng)烈的響應(yīng)程度在其他昆蟲(chóng)中未見(jiàn)報(bào)道。生活在同一地區(qū)的光滑鱉甲成蟲(chóng)在45℃處理5-15 min 就能顯著誘導(dǎo)hsp70的表達(dá)(陳亮等，2007)。hsp 基因?qū)Ω邷孛{迫的響應(yīng)是在非正常生長(zhǎng)溫度下出現(xiàn)的，果蠅在37℃出現(xiàn)熱激響應(yīng)(Salvucci et al.，2000)，而荒漠昆蟲(chóng)是在37℃以上，表明適應(yīng)沙漠環(huán)境的昆蟲(chóng)可以耐受更高的高溫，并且響應(yīng)非常迅速。值得注意的是，除1 齡幼蟲(chóng)外，小胸鱉甲各齡幼蟲(chóng)hsp70的表達(dá)對(duì)高溫的響應(yīng)程度與其本底水平呈顯著的負(fù)相關(guān)，本底水平較低的2-5 齡幼蟲(chóng)hsp70的表達(dá)對(duì)高溫的響應(yīng)非常強(qiáng)烈，提示小胸鱉甲HSP70 在應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。對(duì)雌性B 型煙粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)和肩突硬蜱 Ixodes scapularis的hsp23/hsp20 和hsp70 基因進(jìn)行RNA 干擾，影響了昆蟲(chóng)對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)，降低了在高溫下的存活率(Lü and Wan，2011;Busby et al.，2012)。抑制紅尾肉蠅Sarcophaga crassipalpis hsp23或hsp70的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致其非滯育蛹耐熱性的降低(Rinehart et al.，2007)，表明hsp70 基因參與昆蟲(chóng)對(duì)高溫的耐受，并發(fā)揮重要作用。

昆蟲(chóng)接受短時(shí)間溫和低溫脅迫后耐寒性增強(qiáng)的現(xiàn)象叫做冷馴化(cold acclimation) (Denlinger，1991)。冷馴化是昆蟲(chóng)對(duì)環(huán)境溫度變化的一種生態(tài)適應(yīng)機(jī)制，其中可能包含hsp 基因的表達(dá) (Qin et al.，2005)。本研究中，小齡幼蟲(chóng) (1 齡)hsp70 基因受5℃和10℃誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá);中齡幼蟲(chóng)(4 齡)hsp70 基因?qū)?℃和10℃低溫的響應(yīng)程度較弱;而大齡幼蟲(chóng)(7 齡)hsp70 基因除10℃脅迫1 h 上調(diào)表達(dá)外，在低溫下受到抑制，表明不同齡期的幼蟲(chóng)對(duì)低溫脅迫的程度和時(shí)間所做出的響應(yīng)方式有較大不同。對(duì)黑腹果蠅的研究也發(fā)現(xiàn)其hsp70，hsp23 等基因的冷誘導(dǎo)表達(dá)和年齡顯著相關(guān)(Colinet et al.，2013)。分析hsp70 表達(dá)與幼蟲(chóng)耐寒性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者之間沒(méi)有直接對(duì)應(yīng)關(guān)系。前期研究表明小胸鱉甲在1 齡幼蟲(chóng)期間不進(jìn)食，依靠體內(nèi)積累的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)，此時(shí)的過(guò)冷卻點(diǎn)可達(dá)-21.8℃ (劉曉靜等，2012)，因此1 齡幼蟲(chóng)無(wú)論是否冷馴化在-10℃的存活率都可接近100%，hsp70 基因表達(dá)對(duì)其耐寒性的影響可能在接近過(guò)冷卻點(diǎn)的溫度可以體現(xiàn)。4 齡幼蟲(chóng)存在顯著的冷馴化現(xiàn)象，但是hsp70 在這兩個(gè)溫度下并沒(méi)有表現(xiàn)出強(qiáng)烈的上調(diào)表達(dá)，所以冷馴化現(xiàn)象可能還與其他直接與耐寒性相關(guān)的物質(zhì)合成有關(guān)，如抗凍蛋白或甘油等小分子滲透保護(hù)性物質(zhì)(馮從經(jīng)等，2007)。7 齡幼蟲(chóng)中冷馴化與hsp70 基因的表達(dá)之間也沒(méi)有呈現(xiàn)出相關(guān)性。

通過(guò)本研究可得出如下結(jié)論:荒漠昆蟲(chóng)小胸鱉甲幼蟲(chóng)中hsp70 存在發(fā)育階段性差異表達(dá)，中齡幼蟲(chóng)(3-5 齡)的表達(dá)最低，大齡幼蟲(chóng)(6-7齡)的表達(dá)最高;小胸鱉甲幼蟲(chóng)hsp70的表達(dá)受42℃高溫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，其響應(yīng)程度之高在其他昆蟲(chóng)中未見(jiàn)，表明HSP70 對(duì)荒漠昆蟲(chóng)小胸鱉甲應(yīng)對(duì)高溫脅迫發(fā)揮重要作用;冷馴化對(duì)小胸鱉甲幼蟲(chóng)hsp70的表達(dá)在不同齡期有不同的影響，與小胸鱉甲幼蟲(chóng)的耐寒性無(wú)直接相關(guān)性。本研究所得結(jié)果有助于全面認(rèn)識(shí)HSP70 在荒漠昆蟲(chóng)環(huán)境適應(yīng)性中的作用機(jī)制。

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